夹心法ELISA检测白介素8的实验方法

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ELISA免疫实验技术

Il-8是一种分子 量为8～10kD的多肽，对嗜中性粒细胞，T淋巴细胞、嗜硷性粒细胞具有趋化作用，并可激活嗜中性粒细胞，是一种重要的炎症介质。在严重感染病人的血清中、炎症局部渗出液中都可检测到高水平的IL-8。此外，近年来的研究表明，IL-8可能与各种组织缺血后再灌注损伤的发生有关。我们采用两株自制的单克隆抗体建立了夹心法ELISA用于检测IL-8，敏感性可达156Pg/ml，操作简单，重复性良好，可用于IL-8的基础和临床研究。

一、原理：采用两株识别不同表位的抗IL-8单克隆 抗体，其中一株(4D7)作为包被抗体，以识别和结合待检标本中的IL-8,另一株作为酶标抗体，与结合于包被抗体的IL-8的另一个表位结合并催化底物显色。

二、试剂器材

1. 试剂盒提供包被抗体、酶标抗体、标准品，底物(ABTS)、96孔ELISA板。

2. 包被缓冲液、PBS 、底物缓冲液配制同常规ELISA法。

三、操作步骤：

1. 包被：pH9.5 碳酸盐缓液稀释4D7单克隆抗体粗提γ球蛋白至1μg/ml,加入96孔板,100μl/孔，放4℃,36小时。

2. 封闭：0.1%吐温PBS(Buffer A)冲洗96孔板三次，加3%BSA Buffer A(Buffer B)200μl/孔，放37℃,1小时。

3. 加待检样品：Buffer A 冲洗96孔板三次，加待检样品及Buffer B 稀释的标准品100μl/孔，放37℃,3小时。

4. 加酶标抗体：Buffer A冲洗96孔板五次,3%PEG Buffer A稀释酶标抗体至1∶800，加入96孔板，100μl/孔，放37℃,1小时。

5. 显色：Buffer A冲洗96孔板五次，pH5.4柠檬酸缓冲液溶解底物(ABTS),0.2mg/ml,加3%H2O2,2μl/ml，加入96孔板，100μ/孔，室温下或37℃显色。

四、注意事项：

1. 待检标本如为血清，应采用一次性容器，血液采集后尽快(6小时以内)分离血清。

2. 封闭液或抗体稀释液应新鲜配制或冻存。