夹心法ELISA检测可溶性白介素2受体实验方法

相关专题

 

可溶性白细胞介素2受体SIL-2R存在于人的血清、尿液及脑脊液中，其浓度的高低与许多疾病的发生、发展、治疗效果及预后有密切联系，如成人T淋巴细胞白血病(ATL)艾滋病、B细胞慢淋、毛细胞白血病，以及肾移植后发生急性排斥反应时或异基因骨髓移植发生移植物抗宿主时，患者血清中SIL-2R水平明显升高。SIL-2R的检测多采用酶联免疫吸附技术，其中夹心法ELISA是一种较简单的检测方法，国外已广泛应用于临床及基础免疫学 研究。

㈠ 基本原理：

将抗Tac特异性单克隆抗体Ab1吸附于固相载体 ，识别细胞培养上清或血清等标本中Tac并与之结合。应用辣根过氧化物酶标记的识别另一种Tac表位的特异性单克隆抗体Ab2识别固定于固相载体的Tac并与之结合。通过酶催化底物显色反映待检标本中游离Tac的水平。

㈡ 操作步骤：

1. 刺激外周血单个核细胞(PBMC)：取外周血10ml，肝素抗凝，常规分离单个核细胞，加至24孔细胞培养 板，2×106/孔，RPMI1640-10%FCS+PHA(3μg/ml，Wellcome公司，37℃、5%CO2培养72小时,收集上清，-20℃保存待测。同时设未加PHA对照组。犚2可选用病人血清为待测标本。

2. Ab1包被：用0.05MpH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗Tac特异性单克隆 抗体(Ab1)犗!释至5μg/ml，加至ELISA板，100μl/孔，4℃包被72小时。

3. 封闭：1%BSA-PBS 封闭，350μl/孔，37℃孵育2小时。

4. 加样：ELISA板用PBS-T洗液洗3次，牻+PHA刺激单个核细胞培养上清及对照组上清或病人血清倍比稀释至1∶1024，每一稀释度取100μl加至ELISA板。犙!HUT-102B2细胞培养上清为阳性对照，RPMI1640-10%FCS培养液为阴性对照。37℃，孵育2小时，洗涤。

5. 加酶标抗体：于各反应孔加辣根过氧化物酶标记另一种抗 Tac 特异性单克隆抗体Ab2以效价滴定的最佳稀释度稀释)100μl。37℃孵育2小时，洗涤。

6. 加底物显色：各反应孔加新鲜配制ABTS底物溶液100μl，37℃、孵育15分钟。

7. 终止反应：各反应孔加2%氟化钠终止液50μl。

8. 结果判定：首先肉眼观察反应孔内颜色，稀释梯度是否均匀。阳性、犚u性结果是否明显。然后于ELISA检测仪上测各孔O.D值(410nm)。

㈢ 试剂器材：

1. 试剂：包被缓冲液、洗涤液、稀释液、终止液配制同常规ELISA方法。Tac特异性单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的Tac特异性单克隆抗体,HUT-102B2细胞培养上清,PHA。

2. 器材：聚苯乙烯塑料板，ELISA检测仪，37℃水浴箱，4℃冰箱，CO2孵箱。可调加样器。

㈣ 注意事项：

1. 包被抗体活性要较高，否则影响本实验敏感性。

2. 经筛选比较，封闭液以1%BSA-PBS为好。

3. 酶标结合物应用前应进行效价滴定，选择最佳工作浓度。

4. 底物应选用灵敏度较高的供氢体如ABTS等。

5. 如有条件，酶标McAb可由生物素-McAb和亲和素-HRP系统代替，以增加实验的敏感性。