组织切片各个步骤中经常遇见的问题和克服策略

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据统计，常规的组织切片实验要历经9个步骤，每个步骤又分为2~20个小步骤，整个实验完成需四个步骤以上。本文就组织切片染色各个步骤中常见问题及解决方法进行概括总结，与同道中人共勉之。

常规组织切片的制作过程较繁琐，按具体制作效能分为固定、取材、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、封片等九大步骤。其中脱水有12 个步骤、透明有2 个步骤、浸蜡有3 个步骤、染色有23 个步骤，一般要经过总计40～45 个步骤，各个实验室根据自身的实际情况及工作习惯各有不同。

1 固定和取材

组织切片的固定剂主要为甲醛和酒精，固定剂可与蛋白质交联结合、使之变性，组织硬化、结构固定,此外其本身的变性物质可与染料结合，增强着色能力。同时，固定交联和沉淀蛋白质、脂肪、糖、酶等细胞内物质成分，产生不同的折光率，使得光学显微镜下易于更清晰地观察组织细胞的微细结构。

1.1 减少或去除组织切片中甲醛颗粒

甲醛饱和液偏酸，影响细胞核 的染色，特别是放置较久后，易析出沉积在组织切片中，呈细小的黑褐色或黄黑色颗粒物，影响观察。以甲醛饱和液和pH7.2 的PBS 缓冲液配制的10%中性甲醛固定液( 体积比为1∶9) 应用最普遍，效果也相对较好，可以减少和消除甲醛颗粒。如果现场无法配制PBS 缓冲液，可在固定溶液中加入一些普通白粉笔，使溶液呈中性或弱碱性。甲醛颗粒易于出现在血液和血浆分布区，以及自然腐败较重的组织，可作为组织出血和血浆渗出指示剂。

1.2 防止组织固定不良

固定液过浓或过稀释，渗透组织的能力就差，组织固定不均匀，出现中央区组织固定不良。不仅取材时,组织软硬不均，切面不平整，影响切片时修平组织观察面，组织固定不良还会影响脱水、浸蜡、染色等效果( 表1) 。一般固定液与检材体积比为1∶10 左右为宜，器官组织完全浸泡于固定液中，固定时间3～7 d。自溶腐败严重组织检材固定时间应适当延长几天，或增加固定液中甲醛浓度( 可按1∶8 比例配制) 。环境寒冷时，亦应适当增加固定液浓度。

固定液每天浸透组织约2～3mm，为快速完全固定组织检材，脑、肝、肺、心、肾、脾等较大器官，均应切开后再固定。全脑应线绳悬吊固定( 普通病理检验，先正中矢状切开胼胝体后固定，可加速全脑固定) ，心应常规切开各房室腔，肺和肾应分别从最大外缘向肺门和肾门正中切一刀，肝、脾常规平行长轴切成2～3 cm厚片，再予固定。如果固定的器官较大、容器较小或固定液较少时，应于固定3 d 内，翻动器官或更换固定液，以免大器官贴壁面压平和固定不良。

1.3 避免组织切片厚薄不均和不规则腔隙

取材一般在解剖之后3～7 d 进行，取材时要刀快手稳，切面平整，厚度3～5mm，避免组织块厚薄不均、观察面不平整，检材组织块大小应略小于所选用的盖玻片1～2mm，以便封胶完全。组织块记号纸应为70 g以上的复印纸，必须碳素笔标记，以免笔迹被脱水透明掉。组织块应流动自来水充分冲洗12 h 以上，尽量洗掉和稀释残留的甲醛溶质和颗粒。

2 脱水、透明、浸蜡和包埋

2.1 脱水和透明

脱水和透明是影响切片质量的重要环节，要保证脱水的彻底而又不过度。首先要保证梯度酒精试剂的浓度、容量，要及时更换。脱水不彻底导致透明时无法置换组织中水分，浸蜡不完全，切片时组织中间出现松软空洞，摊片时切片容易散开，染色时易于脱片、着色不良，蜡块缩水。脱水时要根据不同的组织、大小、年龄，以及动物的标本，调整各步时间。由于丙酮易挥发，要经常更换，以保持浓度。脱水过度组织块变硬,切片时易于碎裂。

2.2 浸蜡

第一缸石蜡中加入少量二甲苯或低熔点软蜡，最后一缸浸蜡和包埋的石蜡的熔点要相同，不然组织与石蜡不能紧密结合，摊片时易解离。浸蜡的时间不宜过长，否则易造成组织块脆硬，切片如豆腐渣样。

2.3 包埋

包埋的石蜡应预先溶解一段时间，以保证石蜡密度均匀，初熔石蜡中含有杂质，应去除沉淀或絮状杂质，保证石蜡干净、致密，利于切片。应根据不同的季节调整包埋蜡的熔点，冬季用56～58 ℃低熔点蜡，夏秋季用60～62 ℃高熔点蜡。包埋时蜡缸温度不超过70 ℃，防止石蜡挥发，污染环境。

3 切片、摊片、烤片

3.1 切片

环境温度高时，切片前可将蜡块放入冰箱冷藏柜预冷30min。刚包埋好的热蜡块不能立刻冷冻，速冷会造成蜡块裂痕，组织块易碎。在刀架上放置组织蜡块时，应注意组织块包埋方向、组织层次等，使纤维和肌肉走向与切片刀刃平行，较难切的组织部分应放在上面，如皮肤表皮、包膜、胃肠道浆膜等，以减少组织断裂现象。操作切片机时应用力均匀，避免用力过重。脱钙的组织、骨髓，以及钙化组织，应选用固定刀口,以减少刀刃过多的缺口。用毛笔展片时，要防止笔丝进入刀口，以免增加刀刃缺口。为了减少刀片损耗，修片时用已经旧刀片，切片时用新刀片，保持新刀片刃锋利、不粘蜡，避免切片皱褶和刀痕。刀刃有缺口时，切片出现豁口，刀刃钝时,切片皱褶、易碎，应及时更换刀口位置或刀片。蜡块夹不紧或刀片变钝时，易跳刀，应重新调整夹板或更换刀片。切片时，动作要轻柔，用力均匀，避免切片厚薄不均。每切一个蜡块都应该把切片刀和刀架的碎片都清理干净，避免组织间的相互污染。如遇难切的蜡片时，可用与蜡块切面大小相仿的薄纸潮湿后贴蜡块表面上切片，然后将附有切片一面朝上放入水中漂片。切片不完整、皱缩或卷片，可能刀不快或切片角度不对，一旦调准最佳切片角度和磨刀角度( 传统的大切片刀) 后不要随意改变。

3.2 摊片

摊片的水温一般为40～45 ℃。摊片时动作要匀速轻柔，避免皱褶和产生气泡。水温过高时，切片易离散。出现小气泡时，可用眼科镊尖端在水下小心地移除气泡，以减少脱片和组织破损的机会。室温低时，捞片时将载玻片放入水中片刻，防止切片褶皱而导致脱片。

3.3 烤片

烤片温度应为70℃左右，烤片时间不少于30min。温度过高和时间太长，组织易干固、皱缩，折光增强。

4 染色、封片、归档

染色过程中，首先应保证各种试剂的浓度、体积,不能有沉淀。用Harris 苏木精液时，染色前要先用一张滤纸除去液体表面的结晶，以免污染切片。脱蜡彻底，不然易出现嗜碱性片状模糊，毛玻璃样现象，染色不均。严格控制酒精梯度时间，以免水分过快进入细胞，破坏细胞结构，影响染色效果。染色时调节pH 值很重要，在甲醛溶液中固定时间长的组织块，组织酸化而影响细胞核着色，故应自来水冲洗时间长一些或在稀氨水中处理1～2min，以使细胞核着色较深[4]。胞浆伊红着色不佳时，可在伊红溶液中滴加1～2滴冰醋酸。脱蜡之后，在无水乙醇中时间要足够长，以完全洗去二甲苯。严格控制分化时间，最好在显微镜下观察分化效果，一般以细胞核染色清晰而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。盐酸酒精分化之后冲水时间不少于5min，尽可能洗去胞质中苏木素染液，增强返蓝效果，使背景不遗留过多染色。染色过程中不要让切片干枯，以免切片收缩、变形，影响细胞形态。切片经酒精脱水后，入二甲苯时出现白色不透明状态，脱水不彻底，应更换酒精、二甲苯，将切片退回无水酒精，重新彻底脱水与透明。透明完全的切片显得干净、透亮便于观察。封片树胶浓度要适中，过稀易出现大气泡、溢胶污染切片，影响观片。过稠易出现后薄不均、折光差，及细小气泡。封固过程中，最好直接从二甲苯中取出封片,保持二甲苯不挥发，避免组织大片破裂。切片封固后应放置一段时间，树胶完固后，才能归档，以免溢胶切片相互粘连重叠。根据环境温湿度，一般应放置7～15 d。归档切片应放置干燥避光处，避免切片褪色。

5 结语

完成一个理想的组织切片需要不少的步骤和心血，只有以上一道工序是下一道工序的客户的心态，从容仔细尽心负责地做好每一环节，才能最终摘取到成功的果实。最后希望大家实验顺利。