原核表达（原理、材料与实验方案）

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一、原理
1、 E . coli 表达系统
E . coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-Page 以检测表达蛋白质。
2、 外源基因的诱导表达
提高外源基因表达 水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒 表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。

二、材料
1、诱导表达材料
( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基
酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g
NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%
蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0
适用范围：大肠杆菌
( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃ 保存。
( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液：
50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )
50 mmol / L DTT
2 % SDS （电泳级）
0.1 ％ 溴酚蓝
10 ％ 甘油
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料
1 ）酶溶法
（1）裂解缓冲液：
50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )
1 mmol / L EDTA
100 mmol / LNaCI
（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL 溶菌酶。
（4）脱氧胆酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超声破碎法
( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：
100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )
100 mmol / L DTT
4 %SDS
0.2 ％ 溴酚蓝
20 ％ 甘油

三、实验方案
1、外源基因的诱导表达
( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
( 2 ）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。
( 3 ）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定，
确定无误后进行下一步。
( 4 ）如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30 -32 ℃ 培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6 ，迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5h ；如果表达载体的原核启动子为tac 等，则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。
( 5 ）取上述培养液1 mL , 1000g 离心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS -PAGE 检测。
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
1 ）细菌的裂解
常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为：
① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。弃上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。