western blotting的转膜步骤
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I. 所需材料： •Xcell SureLock™或Xcell Ⅱ™ Mini-Cell以及Blot Module（Cat. Nos. EI10001, EI9001及EI9051）•电泳后的迷你胶（mini-gel）（最大的尺寸9cundefined9cm）•预先切割好的印记膜：
硝酸纤维素（Cat. no. LC2000或LC2001），
PVDF（Cat. No. LC2002）或Nylon+（Cat. No. LC2003）•转印垫（Cat. No. EI9052）•甲醇•去离子水 •转移缓冲液（配方见下文）•用于平衡膜，滤纸和转移垫的浅盘
II. 规格：
转印槽尺寸： 14.5cm x 14cm x 11cm
Blot Module容积：约200ml
下缓冲液槽容积：600ml
Blot尺寸： 约9cundefined9cm
注意：在以下步骤中，应该始终使用手套以避免凝胶和膜的污染，并防止接触电泳和电转过程中常用的刺激物。
Ⅲ 材料制备
a) 转膜缓冲液- 请注意对大多数转膜我们推荐使用强度减半的Towbin缓冲液，其中含有20％的甲醇。使用Xcell Ⅱ转印系统进行成功的转膜，0.5Xtowbin缓冲液就可以提供足够的离子强度，而不产生过多的热量。这种缓冲液可能不适合其它的转印系统，反过来也是这样。一升的转膜缓冲液制备方法如下（ 含20％甲醇的0.5X Towbin）
使用我们的Tris-Glycine转膜缓冲液： 去离子水760 ml转膜缓冲液（Cat. No. LC3675）40 ml(25×未稀释液) 甲醇200 ml总体积1000 ml自己制备Tris-Glycine转膜缓冲液： Tris 碱 (12mM)1.45 g甘氨酸 (96mM)7.2 g甲醇（20％终浓度）200 ml去离子水加至1L总体积1L
请参看Invitrogen 目录648页制备NuPAGE®转膜缓冲液。
b) 制备转印垫－ 用大约700ml的转印缓冲液浸泡转印垫至饱和，浸泡在缓冲液中时注意挤压转印垫去除气泡，这一步骤是必需的，因为不去除气泡可能会阻碍生物分子的转印。
c) 制备转印膜和滤纸－ 将选择的转印膜和滤纸按凝胶尺寸裁好或使用预先裁好的膜/滤纸复合层。
•PVDF膜－预先将PVDF膜在甲醇，乙醇或异丙醇中湿润。在去离子水中稍事润洗后，将膜放入含50-100ml转膜缓冲液的浅盘中放置数分钟。•硝酸纤维素膜/尼龙膜－直接放入转膜缓冲液中数分钟。•滤纸－在临使用前在转膜缓冲液中简单浸泡一下。•凝胶－凝胶应在跑完后立刻使用，讨论见下文。不要将凝胶浸泡在转膜缓冲液中。
Ⅳ 制备凝胶及膜的夹层：
凝胶和膜的夹层以及转印垫应放置在转印模块的阴极，使其与转印单元的底部水平。
转印垫和组装体就位后，在电极的上方应有约1cm的缝隙（图1 ）。
Ⅳ-A. 转印一块凝胶 1.在电泳后，将切胶刀的斜边楔入胶盒两块板之间的缝隙中，撬开每边的三个粘合点。胶盒的凹口（加样孔）面应面向上。在刀柄上来回推动以分离胶板。在胶盒的各边缘重复直至胶板完全分离。当将切胶刀插入到两块胶板之间时必需小心，以免对凝胶压力过大。
2.当打开胶盒时，凝胶会粘附在胶盒的一边。小心移除无凝胶的胶板，使凝胶留存在另一块胶板上。用切胶刀切除加样孔。
3.将一片预先浸泡过的滤纸放在凝胶顶部，刚好在凝胶底部的"底脚"的上部（不覆盖凝胶的底脚）。使用转印缓冲液持续饱和滤纸，确保赶走了进入的气泡。可以使用玻璃移液管作为滚筒，轻轻在表面滚动，从而很容易做到这点。
4.将胶盒翻转，使凝胶和滤纸面向下放置在戴手套的手掌上或者放有一片Parafilm?膜的干净平面上。使用下面的一种方法将凝胶从胶板上分离：
a） 如果凝胶在较长（有狭缝）的胶板上，用切胶刀通过胶盒上的狭缝轻推底部，凝胶将很容易从胶板分离。
b) 如果凝胶在较短（有凹口）的胶板上，使用切胶刀小心松凝胶的底部，使凝胶从胶板滑离。
