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酸性磷酸酶的显示方法

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一、实验目的
1. 掌握Comori 法的基本原理和方法。
2. 观察酸性磷酸酶在细胞内的分布状况。

二、实验原理
酸性磷酸酶能分解磷酸脂而释放出磷酸基,在PH5.0 的环境中,磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅。但因其是无色的,所以再经过与硫化铵作用,形成棕黑色的硫化铅沉淀,由此就能显示酸性璃酸酶在细胞内的存在与分布。
本实验的技术特点是:①用冷冻涂片和中性福尔马林固定,可避免在固定、包埋及制片过程中酶的失活,保证了实验的稳定性。②采用较短的作用时间,可避免细胞质内其它蛋白质及核内出现阳性假象,保证了实验的可靠性。③以姬姆萨染色的巨噬细胞为观察对象,细胞核 及细胞轮廓以及细胞质中反应沉淀的颗粒都比较清晰,有助于深入理解细胞吞噬作用、浴酶体功能和分布以及溶酶体标志酶——酸性磷酸酶的性质。

三、实验用品
(一)材料小鼠腹腔液涂片(重点观察巨噬细胞)
(二)器材高压灭菌锅、冰箱、注射器、载玻片、盖玻片及温箱。
(三)试剂
1. 10%中性福尔马林(pH6.8~7.2)
甲醛 10ml
醋酸钠 2g
蒸馏水 90ml
2. 酸性磷酸酶作用液
蒸馏水 90ml
0.2mol/L 醋酸缓冲液(pH4.6) 12ml
5%硝酸铅 2ml
3.2%β-甘油磷酸钠 4ml
先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合,随后分成大致相等的两份,一份中加醋酸铅溶液,另—份加甘油磷酸钠溶液,然后再将两者缓缓混合,边混匀边搅匀。若PH<5.0,可加少量醋酸调节。临用前配制。配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀,否则将严重影响实验结果。
3. 1%硫胺溶液
硫化胺 1ml
蒸溜水 9ml
4. 姬姆萨染液(1:30)
姬姆萨原液 3 滴
磷酸盐缓冲液(PH6.8) 5ml
5. 3%淀粉肉汤
牛肉膏 0.3g
蛋白胨 1.0g
氯化钠 0.5g
蒸馏水 100ml

高压灭菌9.9×104Pa(15 磅)20min,再加入可溶性淀粉6g,60~80℃水浴溶
解后,4℃冰箱保存备用。

四、实验操作
1. 取小白鼠1 只、每日腹腔注射6%淀粉肉汤1m1,连续注射3 天。
2. 第3 天注射后3~4h,脱颈处死小鼠,打开腹部皮肤,暴露腹膜,再向腹腔内注射生理盐水2ml,过3min 后在原注射部位抽取腹腔液0.1~0.2ml。
3. 将腹腔液滴在预冷的载玻片上,每片1~2 滴。将玻片垂直插入玻片架,迅速放到冰箱内(4℃),让细胞自行铺展。
4. 30min 后,将玻片转入10%中性福尔马林,4℃冰箱内固定30min。
5. 自来水漂洗5min,把水沥干。
6. 转入酸性磷酸酶作用液中,37℃处理30min。
7. 自来水漂洗片刻。
8. 1%硫化胺处理3~5 min。
9. 自来水冲洗,甩干。
10. 用1:30 的姬姆萨染液染色15min。
11. 自来水冲去染液,用磷酸盐缓冲液临时封片,镜检。
12. 对照实验

将第3 步的腹腔液涂片置50℃温箱中处理30min,使酶失活,再进行6~11
步的同样实验。

五、实验结果
在巨噬细胞的细胞质中,出现许多棕色或棕黑色的颗粒和班块。部分细胞内,酸性磷酸酶极为丰富,整个细胞质区域都有黑色沉淀。中性粒细胞呈现阴性反应。
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