小鼠的R1胚胎干细胞系培养实验步骤
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以下是根据NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干细胞培养 protocol整理而成。根据经验作部分修改。
1、一般培养：保持胚胎干细胞 处于未分化状态
培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代
2 、体外分化
培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板(使用或不使用盖玻片)
体外分化方法
注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养
维持ES细胞处于未分化状态
ES细胞培养用含有LIF(白血病抑制因子)和Feed细胞的培养基(高糖)来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1%明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2-3天从达到80%-90%融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1%明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5%CO2，100%湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基
ES：
配制一20×不含DMEM ，HS，LIF的溶液(该溶液也能用于EB培养基--见下文)。分装在50ml 离心管中，(稀释为2×，每管42ml)，贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。贮存液DMEM(高糖)马血清(HS)L-谷氨酰胺(200mM)MEM NEAA(10mM)HEPES(1M)β-巯基乙醇(55Mm)PESTLIF
复苏细胞
细胞被冻存在10%二甲基亚砜(DMSO)中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1、从液氮中取出一管细胞;2、将冻存管置于37℃水浴中2分钟(或放到管内溶液恰好完全溶解);3、将细胞转移到一15ml Falcon管中;4、加入5ml ES培养基(用培养基冲洗冻存管);5、离心3分钟;6、弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次;7、接种在明胶包被(见下文)的6孔或6cm组织培养皿;8、孵育。
冻存细胞
冻存液：90%HS和10%DMSO
步骤：1、1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内;2、用细胞刮刀收集细胞;3、将细胞转入15ml 离心管管内并离心3分钟;4、弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中(10 cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6-7ml。)5、分装于冻存管内，每管1ml;6、置-80℃过夜，第二天移入液氮。
Geltin(明胶)包被
准备500ml 0.1%geltin溶液1、将0.5 g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中(50-65℃水浴15～30分钟)。2、最好在溶液没有冷却的情况下通过0.22 μm滤膜过滤，贮存在4℃。
包被培养板或培养皿1、加入足量的明胶溶液覆盖培养平面(15 cm培养皿加2ml，10 cm培养皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。);2、置室温30分钟;3、去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平放或倒扣，以免明胶污染盖子和流出培养板。
细胞传代
建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。
1、去除培养液;2、无钙镁PBS(Gibco)洗涤;3、加入胰酶EDTA(Gibco)。37℃孵育5分钟。4、加入ES。培养基使胰酶失活;5、将细胞转入15 ml离心管中离心3min;6、去除上清，将细胞重悬于2 ml ES培养基，至少吹打10-20次。如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。7、将细胞接种在没有包被的组织培养皿中(使用和一开始同样规格的培养皿)放入温箱2小时(分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮);8、将含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开(前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向)9、建议按1：4-1：10的比率传代 (ATCC)
保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。
