人胚胎干细胞传代培养

胚胎干细胞是具有一种具有自我更新和全能分化能力的细胞，能发育分化出成体所有的组织和器官，是体外研究发育调控机制最为理想的模型，也是用于人类疾病的干细胞治疗和器官组织移植最理想的种子细胞。建立新的人类胚胎干细胞系仍然有很大的伦理学争议，目前对人胚胎干细胞的研究主要就是基于已经建立的人胚胎干细胞系的研究。

人胚胎干细胞传代培养的原理是人胚胎干细胞快速生长和扩增，而细胞培养箱恰恰能提供培养所需的环境。

胚胎干细胞常用于发育分化出成体所有的组织和器官，是体外研究发育调控机制最为理想的模型，也是用于人类疾病的干细胞治疗和器官组织移植最理想的种子细胞。

器材：37 ℃ 水浴锅、一次性无菌培养皿、一次性无菌移液管

T75 培养瓶、15 mL 离心管、注射器和针头、涂有明胶的 6 孔板

试剂、材料：提前制备好的饲养层细胞、95％ 乙醇

人胚胎干细胞传代培养的基本过程可分为如下几步：

（一）试剂配制

1. 胶原酶溶液的配制使用浓度 1 mg/mL。胶原酶，30 mg；DF12 培养基，30 mL。使胶原酶充分溶解于 DF12 基础培养基。用 0.22 μm 滤器过滤除菌。

2. 胚胎干细胞培养基的配制 DF12 培养基，200 mL；血清替代物 50 mL ；200 mmol/L -谷酰胺 ＋ 2-巯基乙醇溶液，1.25 mL；非必需氨基酸 100x 溶液，2.5 mL ；b-FGF 溶液，5 mL 。

所有组分都加入 250 ml 培养瓶中，用 0.22 μm 滤器过滤除菌。培养基最好在 2 周内使用。

3. 200 mmol/L -谷酰胺 ＋ 2-巯基乙醇溶液的配制 200 mmol/L -谷酰胺，5 mL；2-巯基乙醇，7 μl，混匀。

4. b-FGF的配制b-FGF，10 μg ；0.1％BSA无菌，5 mL 溶解后按0.5 mL 每份分装冷冻保存。

（二）确定传代时机

通常以下情况时，胚胎干细胞需要传代

1. 小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）饲养层超过 2 周。

2. 胚胎干细胞的克隆密度太高或克隆大小太大。

3. 胚胎干细胞克隆出现分化现象。

（三）胶原酶处理

1. 需要传代时，将胚胎干细胞培养板从培养箱取出，吸去培养上清。

2. 6 孔板培养时，每个孔加 1 mL 胶原酶溶液。

3. 处理至少 5 min。

4. 倒置显微镜下观察，直至细胞克隆从培养板表面脱离。注意：可以看到克隆周边会出现皱褶。根据消化情况，胶原酶处理时间可再延长 6~10 min。

5. 刮细胞

① 玻璃移液管，将细胞从培养板表面刮下来。

② 同时轻轻吹打胶原酶溶液，使细胞从培养板上面完全脱离。

③ 所有细胞团都留在培养板中，直到整个 6 孔板都按步骤（1）、（2）处理完。

注意：这些步骤可以直视下完成，也可以在解剖纤维镜下完成。

（五）收集并打散克隆

1. 将整块 6 孔 板的细胞都转移到一个 15 mL 离心管中。

2. 每个孔加 1 mL 胚胎干细胞培养基冲洗，并将冲洗液也转移到细胞悬液中。

3. 在 15 mL 离心管中，轻轻吹打细胞悬液数分钟，进一步打散细胞克隆。注意：吹打时避免产生气泡。

（六）离心传代

1. 将打散的细胞克隆，200 g 离心 5 min 。

2. 去除上清液。

3. 轻轻拍散细胞团，加 2~3 mL 胚胎干细胞培养基重悬细胞，轻轻混匀。

4. 200 g 离心5 min 。

5. 胚胎干细胞离心同时，将提前准备好的饲养层培养板取出，吸弃 MEF 培养基。

6. 用 6 孔板培养的饲养层，每个孔加 1 mL PBS，轻轻晃动，洗去培养基中所含的血清。

注意：PBS 处理成纤维细胞的时间不要超过 6~10 min。

7. 胚胎干细胞离心结束后，弃去上清液，轻轻拍散细胞团。

8. 加入 2~3 mL 胚胎干细胞培养基，重悬细胞。

9. 再加入足够的胚胎干细胞培养基，使 6 孔 板的每个孔细胞悬液体积为 2.5 mL。

10. 去除饲养层培养板中的 PBS，每个孔加入 2.5 mL 细胞悬液，用移液管轻轻混匀。

11. 在水平台面上，短促地上下左右地晃动培养板，使加入的胚胎干细胞均匀分布到饲养层上。

12. 将培养的胚胎干细胞放入培养箱，使克隆重新贴壁。注意：在重新贴壁的这段时间内，要尽量少开关培养箱，维持培养环境的稳定，以利于胚胎干细胞重新贴壁。

13. 每天更换新鲜培养基。注意观察克隆生长状态，在需要时按上述步骤再次传代。

（七）冻存

1. 按上述步骤收集胚胎干细胞细胞悬液，200 g 离心 5 min 。

2. 配好的冻存液（90％ 胎牛血清，10％ DMSO）置于冰上备用。

3. 弃去上清液，将细胞团排松散后用冻存液重悬，逐滴加入冻存液，混匀。一般一个 6 孔培养板冻 6 支，重悬时每个培养板的细胞加 6 mL 冻存液。

4. 迅速将 1 mL 细胞悬液装入 1.5 mL 冻存管。盖紧后放入异丙醇冻存盒中。

5. 将冻存盒降至室温后，转入 -80 ℃ 冰箱，保存过夜。

6. 次日将冻存的细胞转入液氮罐保存。

注意：人胚胎干细胞冻存前不能将细胞消化成单细胞，消化后的细胞团块稍大为好。

（八）复苏

1. 将冻存的胚胎干细胞从液氮中取出，浸入 37 ℃ 水浴，轻轻转动，注意冻存管盖不要没入水中。

2. 当只剩一个小冰晶时，将冻存管从水浴中取出。

3. 将冻存管浸入 95％ 乙醇浴消毒，在无菌超净台中晾干。

4. 将细胞从冻存管中转入 15 mL 离心管中，逐滴加入 4 mL 胚胎干细胞培养基，轻轻混匀。

5. 200 g 离心 5 min，去除冻存液。

6. 去除上清液，将细胞团轻轻拍散，加 2.5 mL 胚胎干细胞培养基重悬细胞。

7. 将细胞悬液转移到铺有照射后的饲养层细胞的 6 孔板中。每孔加 2.5 mL 细胞悬液。饲养层细胞提前用 1 mL PBS 洗一遍，去除血清。

8. 放入培养箱，第二天将细胞上面漂浮的死细胞吸去并换液，按常规方法继续培养。

9. 每天观察细胞密度，按需传代。

1. 所有试剂都应记录保质期和批号，小包装分装保存，避免反复冻存。培养基配制后最好在 2 周内用完。

2. 胚胎干细胞克隆的消化液可有多种选择，除了上文介绍的胶原酶消化，也可用 0.05％ 的胰蛋白酶消化，消化时间比胶原酶消化所需时间要短，一般 1~2 min，待克隆周边有皱褶时，要加用 MEF 培养基中止胰蛋白酶作用，其他步骤基本一致。

3. 用消化传代的时候务必不能将人胚胎干细胞消化成单个细胞，否则克隆形成率很低。

4. 传代时细胞密度很重要，人胚胎干细胞一般的传代比例是 1:5~1:10。接种的细胞太少不易生长，最好 4~6 d 传代一次。

5. 人胚胎干细胞对营养要求很高，因此必须每天换液，细胞一般培养在 6 孔皿中。

6. 一般使用第 2~4 代 的小鼠成纤维细胞（MEF）作为饲养层细胞。细胞接种到培养皿后一般在 3 d 内使用，放置时间过长的饲养层细胞不利于人胚胎干细胞生长。

7. 人胚胎干细胞的培养环境是 37 ℃ ，饱和湿度，5％ CO₂。培养箱应当每月清洗和衡一次，最好不要在同一培养箱内再培养其他种类的细胞，以免交叉污染。