小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

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以下是根据NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干细胞培养 protocol整理而成。根据经验作部分修改。

1、一般培养-保持胚胎干细胞 处于未分化状态

培养基

细胞复苏

冻存细胞

明胶包被

细胞传代

2 、体外分化

培养基

包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板(使用或不使用盖玻片)

体外分化方法

注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。

一般培养--维持ES细胞处于未分化状态

ES细胞培养用含有LIF(白血病抑制因子)和Feed细胞的培养基(高糖)来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1%明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2-3天从达到80%-90%融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1%明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5%CO2，100%湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。

培养基

ES:

配制一20×不含DMEM ，HS，LIF的溶液(该溶液也能用于EB培养基--见下文)。分装在50ml 离心管中，(稀释为2×，每管42ml)，贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。

贮存液

DMEM(高糖)

马血清(HS)

L-谷氨酰胺(200mM)

MEM NEAA(10mM)

HEPES(1M)

β-巯基乙醇(55Mm)

PEST

LIF

复苏细胞

细胞被冻存在10%二甲基亚砜(DMSO)中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。