Northern杂交实验指导之一：RNA提取
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方法一、改良异硫氰酸胍提取法
试剂及其配制
异硫氰酸胍变性液：
贮存液-在含484ml 水(经DEPC处理), 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠(pH7.0)和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍，加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。贮存液室温保存备用(不超过3个月)。
工作液-在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。工作液于室温下保存不超过1个月。工作液各成分的终浓度为：
4mol/L异硫氰酸胍
25mol/L柠檬酸钠pH 7.0
0.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)
0.1mol/L巯基乙醇(2-ME)
其它溶液：
2mol/L乙酸钠 (NaAc) 缓冲液 (pH 4.0)
水饱和酚(pH 3.5)
49∶1 (v/v) 氯仿/异戊醇
100%异丙醇
70%乙醇(用DEPC处理水配制)
DEPC处理后高压灭菌水
试验程序
1.取0.5~1g左右新鲜植物 组织置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。
2.将粉末全部移入冰上预冷的离心管中，并向其中加入5ml异硫氰酸胍变性液，轻轻摇动离心管使混合均匀。
3.顺序加入2mol/l NaAc 0.5ml、水饱和苯酚5ml、氯仿/异戊醇1ml，每加入一种试剂都轻轻摇动离心管混合均匀，最后将离心管盖紧，倒转几次混合均匀，冰浴15min.。
4.4℃条件下15000g离心30min.，将上层水相转移至另一干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱冷冻1h.。
5.4℃条件下13000g离心25min.，小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml异硫酸胍变型液中(体积为第一次变性液的1/3)，再加入等体积的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱冷冻1h.。
6.4℃条件下13000g离心20min.，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于适量体积(50μg/100μl)的DEPC处理水中，检测后分装，置于-70℃低温条件下保存。
注意事项
RNA提取 过程中，为了保证所提取的RNA的纯度和完整性，其中有两个方面的问题需要特别控制，一是去除与RNA结合的蛋白质，二避免内外源Rnase对RNA的降解。在RNA的提取中，常采用的蛋白质变性剂有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸钠(SDS)等。为防止外源Rnase的污染，所有试验用品均需用DEPC处理并高压灭菌，所有试剂配制均需使用经DEPC处理过的水或灭菌处理。内源RNase的抑制采用异硫氰酸胍等强还原剂。为避免人体污染，所有试验操作均应带手套，避免人体接触所有用品。
方法二、改良Krapp提取法
试剂及其配制
RNA抽提掖：
母液：4mol 异硫氰酸胍
20mmol EDTA
20mmol MES
pH 7.0
工作液：取400ml母液加入1.7ml 2-ME贮存在4℃条件下备用。
RNA重悬液：2mol LiCl
10mmol NaAc
调整终体积为250ml，pH 5.2，灭菌后贮存在4℃条件下备用。
试验程序
1. 取新鲜植物材料0.5~1g，冷冻干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入 10ml RNA抽提掖充分混匀。
2.4℃条件下8000rpm离心10min.，将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4℃条件下8000rpm离心10min.。
3.上清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次(加入10ml氯仿充分混匀后，在4℃条件下8000rpm离心10min.)。
4.小心将上清液转移至另一干净离心管中，加入1/10 vol 3mol NaAc和2 vol冷无水乙醇，在-80℃条件下沉淀2小时。
5.在4℃条件下8500rpm离心30min.，小心弃去上清液，沉淀重悬于RNA重悬液中，置于4℃条件下1小时。
6.4℃条件下8500rpm离心10min.，弃去上清液，沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。检测后分装，置于-70℃条件下保存。
