RNA提取与Northern杂交
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一、 总RNA的提取
1、 取组织10-50毫克，剪切成大小在0.5厘米以内的碎片，加入×5的RNA later（约2毫升）。样品在37度可保存1天。室温下1周，4度下1个月。
2、 匀浆：
用Rnase Erase spray（ICN）清理匀浆器头部（7mm），用DEPC水和乙醇清洗，将上述样品用镊子转移到消毒过的（无菌）盛有500微升tripure的管中，开始匀浆。将匀浆液转移到Eppendorf doff中，另用500微升的tripure清洗管并且一并转入到Eppendorf doff中，然后用DEPC水和乙醇清洗清理匀浆器头部，防止样品交叉污染。
3、样品在室温下静置5分钟。
4、每管加200微升三氯甲烷（氯仿），轻轻混合均匀，室温下静置培养15分钟。
5、离心。4度，12 000g，15分钟。
6、离心后，可见到三层：上层没有颜色。中间层是白色。底层是红色。用1毫升的吸管小心将无色的上清液转移到另一个Eppendorf doff中，保留白色和红色用于DNA和蛋白分析。
7、每管加500微升异丙醇，轻轻混合均匀，室温下静置5-10分钟。
8、离心。4度，12 000g，10分钟。
9、用1毫升的吸管弃去上清液，用75%乙醇清洗沉淀物，小心搅拌，尽量使沉淀物能够漂浮在乙醇上面。
10、离心。4度，7 000g，5分钟。
11、用1毫升的吸管弃去上清液，在空气中干燥10分钟。
12、用甲酰胺（做Northern）或者DPEC水（做RT-PCR）清洗沉淀物，剂量依RNA沉淀物的多少而定（范围为50-500微升），样品在55-60度下加热10分钟。然后保存在-80度冰箱中备用。
二、RNA凝胶和浓度检测
检测RNA的质量：检测18s和28s核糖体RNA，样品含总的RNA-rRNA、tRNA、mRNA。
1、1.2%检测胶（check gel）（100毫升）
Agrose： 1.2g
10×MOPS 10ml
DEPC H2O 74ml
混合均匀，用微波炉加热溶解，然后稍微冷却。再加16 ml甲醛，混合均匀后，将溶液转入凝胶容器中，发生聚合作用，约20分钟。
当胶发生聚合作用后，加入undefinedMOPS将胶封住。
2、 Loading Buffer ：200ul（每个样品10 ul）
10×MPOS 20 ul
甲醛 32 ul
甲酰胺 100 ul
Dye 40 ul
DEPC H2O 8 ul
Dye ： 0.2% 溴苯酚蓝 50%甘油（丙三醇） 1m MEDTA
对于检测胶：加1-2 ul EB，以便于样品在UV光可以看清楚，可以看到两条带，18s：1，900bp和28s：4，900bp。
但是对于Northern胶，则不需要加EB。
3、RNA浓度检测，将样品保持在冰块中。
光谱光度测量：石英玻璃杯中，加样品4 ul，996 ul DEPC H2O，混合均匀后，读取OD值。
型号：光度计
在2个波长260nm和280nm下读取OD值。
比率（A260/A280）表示质量（一般在1.5），A260表示数量。
计算：在260nm波长下，1 OD=40ug/ml
0.229×40=9.16ug/ml
样品稀释度为1：250（4 ul：1 ml）
9.16×250=2290 ug/ml=2.29mg/ml
为了防止样品检测的相互污染，石英杯要用DEPC H2O清洗，并且用吸水纸吸干。
三、RNA电泳
1、样品准备
5 ug RNA +10 ul Loading Buffer
例如：RNA浓度为2.29mg/ml
所以5 ug/2.29=2.18 ul
即2.18 ul样品+10 ul Loading Buffer
65度，加热，15分钟，变性。
变性后将样品至于冰块中，
2、样品loading
在胶的下面放一块黑色的底片，可以看清楚背面。
在转移的过程中间不能有气泡。
电压：90-110V，30分钟。
RNA是负性变化的，所以它从负极（黑色）跑向正极（红色）。
3、跑胶：
1.2% Agrose 胶 300 ml
Agrose 3.6g
10×MOPS 30ml
DEPC H2O 222ml
混合均匀，用微波炉加热，加甲醛 48 ml，冷却后转入到凝胶容器中，发生聚合作用，约20分钟。
当胶发生聚合作用后，加入undefinedMOPS封胶。
4、Loading buffer（10ul每个样）
| 总体积 | 100ul | 200 ul | 500ul |
| 10×MOPS | 10ul | 20 ul | 50ul |
| 甲醛 | 16 ul | 32 ul | 80 ul |
| 甲酰胺 | 50ul | 100 ul | 250ul |
| Dye | 20 ul | 40 ul | 100 ul |
| DEPC H2O | 4 ul | 8 ul | 20 ul |
注： 不加EB
5、样品准备
将样品保持在冰块中。
5ugRNA+ 10ul loading buffer
3等份分装 Eppendorf doff 中 （1） 检测 （2）28s 或者Actin （3）有用的RNA
变性：65度，10分钟，然后将样品放到冰块中。
Prepare letter：： 1-2ul letter+10 ul loading buffer
Loading 样品
小心将样品转移到泳道中，吸管头部不能有气泡
电压：90-120V，1小时。
四、Blotting （transfer）
将电泳胶剪切下来检测RNA。
（1）检测RNA：在胶中加入EB染色。
（2）28S和有用的RNA：
加 0.05N NaOH，20分钟。
DEPC H2O清洗 2-3分钟。
20×SSC 浸泡20分钟。
准备尼龙膜3张和滤纸
转膜：从底部开始
塑料薄膜
滤纸：大小可以盖住20×SSC
胶： 正面向下，以便RNA可以贴着膜，在胶的周围用电影胶片围着。
尼龙膜：一旦用了，就不能够移动了。
滤纸三层：与胶的大小一致。
纸巾：5-8厘米厚。
将上述物品固定后，在上面压一块重物，过夜（或者至少要8小时）
第二天：
将上述物品揭开，将胶正面朝下，膜正面朝上，用铅笔作好标记。
将胶浸泡在EB中1-2分钟，用DEPC H2O清洗，将膜放在滤纸上面，夹好，4度下保存，或者直接进行预杂交。
UV杂交（有助于RNA结合到膜上面）。
五、预杂交和杂交
预杂交和杂交 buffer： 100ul
20×SSC 25ml （5×SSC）
甲酰胺 50ml （50%）
N-lauroylsarcosine： 0.1g（0.1%）
20% SDS 100ul（0.02%）
blocking reagent 2g（2%）
DEPC H2O 25ml
（一）预杂交：
预杂交buffer 在55-65度下加热，温度取决于探针的质量。如果温度低，则会得到更多非特意的条带：对于周探针较好。如果温度高，则会得到高结合力的条带：探针较好。
把膜装进一个塑料袋中，RNA在一边，密封。
在预杂交buffer中培养，55-65度，轻摇，过夜。越长越好。但是要确保溶液盖到膜。
（二）杂交：
buffer 在55-65度下加热，弃去塑料袋中的预杂交buffer，将探针buffer装进，55-65度下培养过夜，轻摇。
注意：预杂交和杂交都是在同一温度下进行。
杂交后：
1、 清洗：室温下用2×SSC，0.1%SDS清洗，5分钟，2次。
2×SSC， 0.1%SDS
10 ml 20×SSC
500ul 20%SDS
加DEPC H2O 至100 ml
2、 清洗： 55-65度，用0.1-0.5 SSC清洗2次，每次15分钟。
SSC buffer 的浓度、温度取决于探针的质量。浓度越低、温度越高，则会得到更高的效果。
Buffer在使用之前要先加热。
3、清洗
室温下用1×MA-T清洗，1分钟，1次。
1×MA-T
100ml 10×MA
900ml DEPC H2O
3ml Tween 20 （占总的0。3%）
10×MA（室温下储存）
1M 顺丁烯二醛
1.5M NaCl
不容易溶解，可以加入70gNaOH 调节到1L。并且调节PH=7。5
4、阻断：
室温下blocking buffer，30 min
blocking buffer
1g 阻断剂
100ml 1×MA-T
稍微加热充分溶解。
5、DIG- Ab
室温下用Ab- blocking buffer，30 min
Ab ：blocking buffer= 1：5，000
重要：抗体离心后取出上清液
6、清洗
室温下用1×MA-T清洗，15分钟，2次。
7、检测
（1）将膜用 detection buffer 培养2-3分钟，即清洗一遍。
detection buffer
100mM Tris-HCL
100Mm NaCl
PH=9.5
（2）将膜取出，置于塑料薄膜上。
（3）用适量的CDP-Star（约1毫升），将膜均匀润湿，涂匀，将塑料薄膜合上，中间不能有空气和皱折。 等待5分钟。
（4）用吸水纸将膜边缘的CDP-Star吸去，用热将塑料薄膜密封。
（5）检测（暗室操作，去校医院放射科）。
（6）分析统计。
