DIG标记的Northern杂交试验指导

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Northern Blotting技术专题

一、 RNA提取

方法一、改良异硫氰酸胍提取法

试剂及其配制

异硫氰酸胍变性液：

贮存液-在含484ml 水(经DEPC处理), 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠(pH7.0)和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍，加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。贮存液室温保存备用(不超过3个月)。

工作液-在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。工作液于室温下保存不超过1个月。工作液各成分的终浓度为：

4mol/L异硫氰酸胍

25mol/L柠檬酸钠pH 7.0

0.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)

0.1mol/L巯基乙醇(2-ME)

其它溶液：

2mol/L乙酸钠 (NaAc) 缓冲液 (pH 4.0)

水饱和酚(pH 3.5)

49∶1 (v/v) 氯仿/异戊醇

100%异丙醇

70%乙醇(用DEPC处理水配制)

DEPC处理后高压灭菌水

试验程序

1.取0.5~1g左右新鲜植物 组织置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。

2.将粉末全部移入冰上预冷的离心管中，并向其中加入5ml异硫氰酸胍变性液，轻轻摇动离心管使混合均匀。

3.顺序加入2mol/l NaAc 0.5ml、水饱和苯酚5ml、氯仿/异戊醇1ml，每加入一种试剂都轻轻摇动离心管混合均匀，最后将离心管盖紧，倒转几次混合均匀，冰浴15min.。

4.4℃条件下15000g离心30min.，将上层水相转移至另一干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱冷冻1h.。

5.4℃条件下13000g离心25min.，小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml异硫酸胍变型液中(体积为第一次变性液的1/3)，再加入等体积的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱冷冻1h.。

6.4℃条件下13000g离心20min.，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于适量体积(50μg/100μl)的DEPC处理水中，检测后分装，置于-70℃低温条件下保存。

注意事项

RNA提取过程中，为了保证所提取的RNA的纯度和完整性，其中有两个方面的问题需要特别控制，一是去除与RNA结合的蛋白质，二避免内外源Rnase对RNA的降解。在RNA的提取中，常采用的蛋白质变性剂有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸钠(SDS)等。为防止外源Rnase的污染，所有试验用品均需用DEPC处理并高压灭菌，所有试剂配制均需使用经DEPC处理过的水或灭菌处理。内源RNase的抑制采用异硫氰酸胍等强还原剂。为避免人体污染，所有试验操作均应带手套，避免人体接触所有用品。

方法二、改良Krapp提取法

试剂及其配制

RNA抽提掖：

母液：4mol 异硫氰酸胍

20mmol EDTA

20mmol MES

pH 7.0

工作液：取400ml母液加入1.7ml 2-ME贮存在4℃条件下备用。

RNA重悬液：2mol LiCl

10mmol NaAc

调整终体积为250ml，pH 5.2，灭菌后贮存在4℃条件下备用。

试验程序

1. 取新鲜植物材料0.5~1g，冷冻干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入 10ml RNA抽提掖充分混匀。

2.4℃条件下8000rpm离心10min.，将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4℃条件下8000rpm离心10min.。

3.上清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次(加入10ml氯仿充分混匀后，在4℃条件下8000rpm离心10min.)。

4.小心将上清液转移至另一干净离心管中，加入1/10 vol 3mol NaAc和2 vol冷无水乙醇，在-80℃条件下沉淀2小时。

5.在4℃条件下8500rpm离心30min.，小心弃去上清液，沉淀重悬于RNA重悬液中，置于4℃条件下1小时。

6.4℃条件下8500rpm离心10min.，弃去上清液，沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。检测后分装，置于-70℃条件下保存。

二、RNA质量检测

提取的RNA需要对其质量和数量进行检测。实验室常用的方法有紫外吸收值检测和电泳检测两种。

方法一、紫外吸收检测

试剂：TE ( 10mmol/L Tris, 1mmol/LEDTA)。

dH2O

试验程序

1.预热紫外分光光度计10～20min.。

2.取两个1ml的狭缝石英杯，一个装入1mlTE溶液作为空白校正液，用来校正分光度计零点及调整透光度至100。

3.取4μl RNA待测样品加入另一比色杯中，加dH2O至1ml，用无菌石蜡膜堵住杯口，倒转混匀。

4.将两个比色杯置于分光光度计中，调入射光波长，用空白溶液分别调整T至100、OD至0，然后测定样品在260nm、280nm、230nm的OD值。

RNA浓度和纯度分析

浓度计算：对于单链RNA，OD260=1.0时，RNA浓度为40μg/ml，按照上述稀释方式，即OD260=0.1时，其RNA浓度为1μg/ml。

纯度分析：纯净的RNA样品其OD260/OD280的比值应介于1.7~2.0，小于此比值说明有蛋白或苯酚污染，如果比值大于2.0则可能被异硫氰酸胍污染;OD260/OD230比值应大于2.0，如果小于此比值说明有小分子及盐类污染。

方法二、变性琼脂糖凝胶电泳检测

试剂及其配制

MOPS缓冲液(10×): 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )

50mmol/L NaAc

10mmol/L EDTA

准确称取41.86g MOPS, 6.8g NaAc, 3.72g EDTA，先用适量的用DEPC处理的水溶解NaAc，再将MOPS溶解其中，再加入已用同样方法处理水溶解的EDTA，混匀后用2mol/Ld NaOH将调整pH 至7.0，最后定溶至1000ml，过滤灭菌后避光保存。

上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝

其它试剂：甲醛(37%溶液，13.3mol/L)

甲酰胺(去离子)

将10ml甲酰胺和1g离子交换树脂混合，室温搅拌1 小时后用Whatman滤纸过滤。等分成1ml于-70℃贮存。

溴化乙锭(EB，10mg/ml)

70%乙醇

试验程序

1.将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。

2.配制琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热溶化均匀。

3.待胶凉至60~70℃时，依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10×MOPS缓冲液和0.5μl溴化乙锭，混合均匀后立即灌胶(注意避免产生气泡)。

4.样品制备：取DEPC处理过的500μl小离心管，依次加入10×MOPS缓冲液2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺(去离子)10μl、RNA样品4.5μl，混合均匀;将离心管置于60℃水浴中保温10min.，再置于冰上2min.;向每管中加入3μl上样染料，混匀。

5.上样：将制备好的凝胶放入电泳槽中(上样孔一侧靠近阴极)，加入电泳缓冲液(1×MOPS缓冲液)，液面高出胶面1～2mm，小心拔出梳子使样品孔保持完好。用微量移液器将制备好的样品加入加样孔，每孔上样20～40μl。

6.电泳：盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于7.5V/ml的电压下电泳2小时左右，当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果。

RNA样品质量分析：

完整的总RNA样品应呈现出三条条带，分别为28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应约为18S rRNA条带亮度的2倍，这表明RNA样品比较完整，基本无降解。如果两条带的亮度反过来，则说明RNA样品已发生降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明RNA样品中有DNA污染。

植物总RNA中28S rRNA及18S rRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kb RNA的迁移率，以此可作为分子量的参考。

三、为制备RNA探针模板的DNA片断亚克隆

A. 载体选择

为了获得能够在体外转录RNA探针的DNA模板，其克隆载体必须带有可供选择的特异转录启动子，同时，为了获得理想的Northern杂交试验结果，载体选择带有两种不同类型而方向相反启动子的载体，以便在RNA探针制备时同时得到两条链的转录探针。

常用的这类载体有：pGEM-3/pGEM-4 ( 2.87kb, SP6/T7 ).

pGEM-3Z ( 2.74kb, T7/SP6 ).

PGEM-3Zf(-) (3.2kb, T7/SP6 ).

Bluescript M13- (2.96kb, T7/T3 ).

按照试验的经济有效原则，本试验选用 Bluescript M13-。

B. 目的DNA序列与载体连接

从所建立的cDNA文库中挑选出带有目的DNA片断的克隆，扩增后提取质粒，采用限制性内切酶处理或采用PCR特异扩增的方法分离出目的DNA片断;采用标准质粒提取方法提取载体质粒(见黄健试验)。然后按下列程序进行连接。

试剂及其制备

T4 DNA连接酶

连接缓冲液(可直接购买或配制)，10X 缓冲液配方为：

0.5 mol/L Tris-HCl pH 7.8

0.1 mol/L MgCl2

50mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)

ATP 5mmol/L ( 如果直接购买商品缓冲液，有的已加在缓冲液中，但有些需单独加入)。

BSA 0.25mg/L

PEG (3500~8000均可，在缓冲液中加入2%~3% 的PEG可提高平端连接效率)。

无菌蒸馏水(SDW)

试验程序

1. 建立以下反应体系(终体积20μl)：

4μl 质粒 ( 50μg/μl)

6μl 目的DNA ( 100μg/μl)

2μl 10X 连接缓冲液

2μl DNA 连接酶

6μl 无菌蒸馏水

2. 反应管置于15℃条件下保温反应24小时，65℃加热10min.终止反应。

3.取5～10μl连接反应物用微型凝胶电泳检测连接效果，其余反应物于-20℃保存备用。

注意事项

1.保证连接反应中目的DNA与质粒载体的浓度比例在3∶1，因为高浓度的DNA有利于片断与载体的连接，低浓度的DNA则会增加载体自连。

2.DNA连接酶对温度敏感，在15℃以上会迅速失活，因此，连接反应的温度控制必须严格。

3.为了保证RNA探针的质量，模板DNA片断的完整性和纯度十分重要，在DNA制备时要严格控制。

C.感受态细胞制备(CaCl2法)

试剂及其配制

LB培养基(200ml)：2g胰蛋白冻、1g酵母浸膏、2g NaCl，溶解后调整pH至7～8，定溶到200ml混匀，分装成50ml/瓶后灭菌4℃保存。

CaCl2 0.1mol/L，4℃保存。

E. coli菌株：JM105或TG1。

试验程序

1.将单菌落菌株接种于5ml LB培养基中，在37℃条件下振荡培养过夜。

2.取0.5ml过夜培养的菌液接种于50ml LB培养基中，在37℃条件下振荡培养约3小时，用分光光度计检测OD600=0.3～0.4时，取出培养瓶置于冰上完全冷却。

3.将菌液转入离心管中，在4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。

4.将沉淀悬浮于预冷的25ml 0.1mol CaCl2中，在冰上放置30min.后，于4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。

5.沉淀重悬于2ml 预冷0.1mol CaCl2溶液中，菌液直接用于转化。或加入1.6ml 80%甘油，按每管200μl分装于2ml的冻存管中，于液氮中速冻后-70℃保存备用。

D. 质粒DNA转化

试剂及其配制

LB培养基(同C)。

氨苄青霉素：用无菌蒸馏水配制成50mg/ml的贮存液。

含氨苄青霉素(AP)的LB平板：每升LB培养基中加入15g琼脂，溶化后高压灭菌，待稍凉后再加入氨苄青霉素至终浓度为50~100μg/ml。在超净工作台上用9cm灭菌培养皿铺板。

IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)：取2g溶于8ml双蒸水中，定容至10ml，过滤灭菌后-20℃保存。

X – Gal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)：贮存液浓度为20mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中，-20℃黑暗保存。

试验程序

1.取制备分装好的感受态细胞，置于冰上5min.，加入连接产物10μl，轻轻混匀后置于冰上30min.。

2.然后置于42℃水浴中热击细胞50s.，再置于冰上2min.。

3.向各管中加入200μl在37℃下预热的LB培养基，37℃下振荡培养1小时。

4.与此同时，将LB平板置于37℃下片刻，每板加入44μl IPTG/X-Gal (4μl IPTG和40μl X-Gal )均匀涂布于平板表面放置约10min.使其吸附渗透。

5.将步骤3中培养的菌液涂布在制好的平板上，吹干后(在超净工作台中放置片刻)置于37℃下培养过夜。含有插入片断的菌落为白色。

E. 转化质粒的快速检测

试剂及其配制

煮沸缓冲液：蔗糖 8%

Triton X-100 1.5%

EDTA(pH 8.0) 50mmol/L

Tris-HCl(pH 8.0) 10mmol/L

LB培养基(同C)

氨苄青霉素(AP)(同D)

试验程序

1.选取白色单菌落，接种到3ml含AP的LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜。

2.将培养物等分成2份按菌落编号，每一菌落编号切勿出错。一份于4℃下保存备用，每一菌落编号切勿出错。另一份转入Eppendorf中，7000rmp离心2min.，弃去上清液，吸干残留液体。

3.将沉淀菌体细胞悬浮于350μl煮沸缓冲液中，加入25μl溶菌酶后，涡旋混合。

4.将管置于100℃沸水中煮40s.，取出立即在12000rmp条件下离心15min.。

5.取10μl上清液，加入溴酚蓝染料后，在0.8%琼脂糖胶上电泳。

6.在紫外灯下根据分子量检测插入片断的完整性。

如果不能确定转化片断的大小，则要进一步杂交、测序分析。选取经检测含有完整目的DNA片断的菌落，转接于2ml TB培养基(每升16g胰化蛋白冻/10g酵母提取物/5g氯化钠)中，37℃下振荡培养过夜，取850μl菌液加入到一2ml的冻存管中，再加入150μl 50%的甘油，混匀后置于液氮中快速冷冻，再置于-70℃条件下保存。

四、模板DNA的制备

A.质粒DNA的小量提取

试剂及其配制

含AP的LB液体培养基

TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)

1mmol/L EDTA (pH 8.0)

溶液I： 25mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)

10mmol/L EDTA

50mmol/L 葡萄糖

高压灭菌15min.后，4℃贮存。

溶液II: 0.2mol/L NaOH

1% SDS(临用前现配制)

溶液III(100ml)：5mol/L 乙酸钾 60ml

冰乙酸 11.5ml

dH2O 28.5ml

4℃贮存。

酚∶氯仿(1∶1)

95%和70%乙醇

试验程序

1.在纯净工作台上将5ml含AP的LB液体培养基加入到一10~15ml通气良好的试管中，然后将前述经鉴定含有目的DNA片断的转化细菌接种其中，37℃下振荡培养过夜。

2.取1.5ml培养物置于一微量离心管中，在4℃下12000rpm离心2min.，弃去上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。

3.将细菌沉淀重悬于100μl溶液I中，剧烈振荡后加入200μl新配制的溶液II，盖紧离心管口，将其快速颠倒5次(切勿振荡)，再加入150μl在冰上预冷的溶液III，盖紧离心管口，将其倒置后轻轻地振荡使溶液III在粘稠的裂解物中分散均匀，再将离心管置于冰上3~5min.。

4.在4℃下12000rpm离心5min.，将上清液移至另一离心管中。

5.加入等量酚∶氯仿(1∶1)，振荡混匀，在4℃下12000rpm离心2min.，将上清液转入另一离心管中。

6.加入二倍体积95%乙醇，振荡混匀，室温放置20min.，在4℃下12000rpm离心5min.，小心弃去上清液，倒置将液滴除尽。

7.用70%乙醇洗涤一次，室温干燥10min.，用50μl含20μg/ml胰RNA酶(无DNA酶)的TE重新溶解质粒DNA，取1μl 在含溴化乙锭的微型胶上进行电泳检测，其余置于-20℃保存备用。

B. 质粒DNA的线性化

试剂及其配制

Not I和Sal I内切酶及其相应的缓冲液

酚∶氯仿(1∶1)

3mol/L NaAc(pH 5.2)

100%和70% 乙醇

DEPC-H2O

试验程序

1.在离心管中依次加入：质粒DNA 10μl (1μg/μl)

10×内切酶缓冲液 10μl

dH2O 80μl

Sal I或Not I 2μl(10U/μl)

2.37℃保温反应2小时以上。

3.消化液用100μl的酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次，每次在在4℃下12000rpm离心5min.

4.将上清液转入一新的离心管中，加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠和2倍体积乙醇沉淀过夜。

5.4℃下12000rpm离心20min.，弃去上清液，沉淀用70%乙醇洗涤一次，真空干燥。

6.线性化质粒DNA按0.25μg/μl的浓度重悬于DEPC-H2O中，取10μl电泳检测线性化质量，其余于-20℃下保存备用。

五、RNA探针制备(根据the DIG system user's guide)

A. 地高辛标记的体外转录

试剂及其配制(试剂盒提供)：

10× NTP标记混合物：in Tris-HCl (pH 7.5)

10mmol ATP

10mmol CTP

10mmol GTP

6.5mmol UTP

3.5mmol DIG-UTP

10× 转录缓冲液：400mmol Tris-HCl(pH 8.0)

60mmol MgCl2

100mmol DTE(dithioerythritol)

20mmol亚精胺

100mmol NaCl

1unit/mlRNase抑制剂。

10unit/μl DNase I (RNase-free)

20unit/μl Rnase抑制剂

20unit/μl T7 RNA聚合酶和T3 RNA聚合酶

4mol/L LiCl

200mmol/L EDTA

DMPC-H2O