幽门螺杆菌生物学性状的研究

 

幽门螺杆菌生物学性状的研究

　　慢性胃病（B型胃炎、 胃溃疡 等）及十二指肠球部溃疡等一类常见病、多发病，长期以来，其病因尚未阐明。1983年澳大利亚学者Warren和Marshall从慢性活动性胃炎病人胃粘膜活检标本中发现并分离出幽门螺杆菌（Helicobacter pylori Hp）后，引起了全世界消化病学与有关基础科学的普遍关注。几年来，各国对Hp的研究迅猛发展，其中主要为临床实用性研究，有关Hp生物学特征相对较少，至于Hp具体致病机理则更少。

　　我们是从1985年开始与上海市消化疾病研究所合作开展这方面研究工作的，我们开初的工作（1985～1986）主要有：①在国内最早分离培养成功了Hp；②对上海地区各种慢性胃病中的Hp检出率作了调查；③用双盲法探讨痢特灵、灭滴灵治疗Hp阳性 慢性胃炎 的疗效，并验证Hp感染与慢性胃病人发病关系。上述研究结果表明：①我国Hp感染率与各种慢性胃病的关系和文献报道的同样广泛和密切；②根据Hp的检出率与各种慢性胃病的高度相关性、Hp感染者经适当药物治疗后与临床症状缓解，以及病理表现改善的密切程度，支持慢性胃病的Hp感染学说。1988年，我们又用Hp超声粉碎的抗原以ELISA法测定了Hp感染的 慢性胃炎 及消化性溃疡病人、健康体检者和新生儿血清中的抗Hp-IgG抗体，结果表明：①B型胃炎及消化性溃疡病人的阳性率明显高于A型胃炎及健康体检组；②体检组中抗Hp-IgG阳性率随着年龄组的增长而升高，30岁～50岁组达最高峰，70岁以上又稍有下降，③新生儿组抗Hp-IgG阳性率反比1/2岁～10岁年龄组为高，接近成人水平。其抗体可能通过胎盘来自母体中，提示Hp是后天获得感染。上述人群中，抗Hp-IgG抗体水平调查的结果又增强了慢性胃病的Hp感染之说。

1987年我们微生物学教研室以“弯曲菌样细菌(Campylobacter-like organisms,CLOS)的生物学地位及致病物质的研究”课题名称申请得到国家自然科学基金的资助。由此对Hp的生物学性状作了比较全面系统的研究，企图对Hp的生物学地位及致病机理作一些探讨。

1 材料和方法

1.1 材料

①标本1985年5月～1989年10月分别取自上海市仁济医院、纺二医院、新华医院有上消化道主述病人的内窥镜检查标本。②菌种Hp均分自病人。除药敏试验和与空肠弯曲菌的交叉反应者外，都以88065，88073，88082，88109，88152五个菌株作为代表进行试验研究。

参考菌种：空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni,CJ）CJ-3276株和结肠弯曲菌F（Campylobacter coli,CC）CC-3278株由法国Borbeaux儿童医院Megraud 博士惠赠，空肠弯曲菌CJ-S131由苏州医学院微生物学教研室提供。胎儿弯曲菌（Campylobacter fetus,CF）日本大阪大学微生物学研究所三轮谷俊夫教授惠赠。

1.2 方法

1.2.1 光学显微镜检查 取胃粘膜活检标本或菌种培养物在洁净玻片上涂薄膜。自然干燥，加热固定，革兰染色后油镜检查。另取胃粘膜活检标本作石蜡包埋切片，四苯胺兰（touidine blue）染色镜检。

1.2.2 分离培养 空肠弯曲菌选择性基础琼脂（上海市卫生防疫站生产）中补充以10%羊血和1%可溶性淀粉，并每1000ml培养基中加入1ml万古霉素（10mg/ml），1mlTMP(5 mg/ml)和1mloctidione(5 mg/ml)制成平板后，置Queue三气培养箱（美国产），气体调节至5%O2，85%N2和10%CO2，37°C培养3d后观察。

　　1.2.3 生化鉴定 主要参考 Cliodna等方法：①氧化酶反应 用竹签挑取血平板上可疑菌落至已被1%盐酸二甲基对苯二胺（E.Mer-ck,Darmstadt产品）溶液浸透、并预先干燥过的滤纸上，10s内出现深紫红色为阳性。②触酶反应 用含3%H2O2液的毛细玻管碰触血平板上菌落，有气泡升起为阳性。③尿素酶反应 将含有菌落棉拭插入尿素肉汤中，30s内棉拭呈粉红色为阳性。④DNA酶试验 在含有甲葳胺兰核酸琼脂的平皿上打孔后，将细菌悬液加于孔中，37°C培养2h后观察结果。小孔周围出现透明小圈者为阳性。⑤碱性磷酸酶反应 用0.02mol/LpH8.0Tris-HCL洗下细菌菌落。加入0.5ml1%磷酸对硝基苯脂（Beckman产品），37°C水浴1 h ,观察结果。呈黄色者为阳性。⑥亮氨酰胺肽酶反应 取小试管2只，1只测定管加待测菌液（约3×1010cfu/ml）0.05ml，另1只空白对照管加H2O0.05ml。然后各加0.2M磷酸缓冲液（pH7.2）0.45ml和基质液（亮氨酰-β-萘胺盐酸20mg溶于H2O25ml，加入0.2mol/LpH7.2的磷酸缓冲液25ml，充分混匀）0.5ml。37°C水浴30min后各加入40%三氯醋酸0.2ml。充分混匀后4000r/min离心沉淀10min。从测定管和空白对照管中各取上清液0.5ml分别装入另2只试管中，并分别加2NHCI0.5ml和0.2%NaNO20.5ml。充分混匀，室温（20°C）中静置10min。再各加0.5%氨基磺酸胺10ml。混匀后，室温（20°C）静置10min 。最后各加N-萘乙烯二胺二盐酸盐溶液[称取N-（1-萘）乙烯二胺二盐酸（分析纯，瑞士，Lichtemptindicht生产）100mg，溶于95%乙醇200ml中，冰箱保存可稳定1个月。临用时，以95%乙醇稀释10位后使用] 2.0ml。20min后观察结果。呈紫色为阳性。⑦马尿酸盐水解试验 接种1环48hCJ/CC培养物或72hHp培养物于0.4ml含1%马 尿酸盐水溶液的小试管中，混匀，放置37°C水浴2h，再轻轻倒入0.2ml茚三酮 试剂 （3.5g茚三酮溶于100ml丙酮:丁醇=1:溶液）于各管。置37°C水浴，经 10min后看结果。深紫色为阳性反应。

1.2.4 抗菌药物敏感性试验 用琼脂稀释法测定13种抗菌物（青霉素G、链霉素、庆大霉素、红霉素、先锋霉素V、四环素、痢特灵、灭滴灵、TMP、洁霉素、次硝酸铋、多粘菌素B、万古霉素）对30个（Hp）菌株（Hp菌株号：85025，85084，85114，85117，85120，85143，85187，85485，85507，85508，85524，85553，85558，85560，85562，85568，85596，85595，85621，85623，85625，85629，85634，85639，85643，85647，85648，85660，85663，85677）的最小抑菌浓度（Minimal inhibition Concentration,MIC）。①菌液准备：待测菌株落分别用生理盐水洗下，比浊调整至108fu/ml。②药敏平板制备：分别取200ul不同种类、不同浓度的抗菌药物稀释（抗菌药物的浓度为0.05μg～100μg/ml的对倍稀释液的对倍稀释系列）置于空的无菌平皿（φ9 cm）中。每只平皿加入加热融化的血琼脂10ml，轻轻摇动使培养基与抗菌药物均匀混合。待琼脂凝固后备用。③细菌拉种：用多点接种器（M2T-P）将菌液点种于上述每只药皿平板上。每个平板点种25个菌种。置微需氧环境中培养3d后观察结果。如Hp在某个抗菌药物浓度的培养基上生长，而在前一个大一倍的尝试的培养基上不长，则以此前一个平板中的抗菌药物尝试为该菌的MIC。

　　1.2.5 菌种保存 挑取3～5环分纯的Hp菌种（菌号：88064，88065，88073，88075，88077，88082，88099，88108，88109，88152，88223，85289，85682，85688）于装有灭菌脱脂牛奶的Eppendorf塑料 离心管 ，置-70°C冻存。经1年后复苏鉴定。

1.3 超微结构的研究

以Hp88065，88073，88082，88109，88152菌株及CJ-3276，CJ-131、CC3278参考菌株制成负染和超薄切片，置H-500透射电镜下观察。取新鲜采集的胃粘膜活检标本经固定后在临界点下干燥，真空涂金。在JEOL JSM0S40扫描电镜下观察。

1.4 Hp的DNA G+Cmol%与菌体脂肪酸组成测定

　　1.4.1 细菌DNA中G+Cmol%含量的测定 主要参赞丁鉴等高压液相 色谱 测定。①Hp DNA的提取；将细菌悬液经4000e/min×15离心沉淀，用0.15mol/LnaCI-0.1M EDTA pH8.0 溶液（SE液）洗一次后，重悬浮于10mlSE液中。加溶菌酶，使终浓度为2％的SDS，放60°C水浴15min。用等体积酚／氯仿・异戊醇（体积之比为3/1）抽提二次后，再用等体积氯仿/异戊醇（体积之比为24/1）和等体积乙醚各抽提一次。水相在pH7.8,10mmol/L Tris-HCI,1mmol/L ED-TA中透析4°C过夜。透析后的抽提液中加入经100°C、15min处理的Rnase，使终尝试为200ug/ml，37°C,2h。加蛋白酶K，终尝试为200ug/ml，37°C轻摇2h。用等体积酚/氯仿（体积之比为1/1）和等体积氯仿・异戊醇各抽提一次。水相加NaCl和0.1M，溶解后，加入