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幽门螺杆菌生物学性状的研究

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幽门螺杆菌生物学性状的研究

  慢性胃病(B型胃炎、 胃溃疡 等)及十二指肠球部溃疡等一类常见病、多发病,长期以来,其病因尚未阐明。1983年澳大利亚学者Warren和Marshall从慢性活动性胃炎病人胃粘膜活检标本中发现并分离出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori Hp)后,引起了全世界消化病学与有关基础科学的普遍关注。几年来,各国对Hp的研究迅猛发展,其中主要为临床实用性研究,有关Hp生物学特征相对较少,至于Hp具体致病机理则更少。

  我们是从1985年开始与上海市消化疾病研究所合作开展这方面研究工作的,我们开初的工作(1985~1986)主要有:①在国内最早分离培养成功了Hp;②对上海地区各种慢性胃病中的Hp检出率作了调查;③用双盲法探讨痢特灵、灭滴灵治疗Hp阳性 慢性胃炎 的疗效,并验证Hp感染与慢性胃病人发病关系。上述研究结果表明:①我国Hp感染率与各种慢性胃病的关系和文献报道的同样广泛和密切;②根据Hp的检出率与各种慢性胃病的高度相关性、Hp感染者经适当药物治疗后与临床症状缓解,以及病理表现改善的密切程度,支持慢性胃病的Hp感染学说。1988年,我们又用Hp超声粉碎的抗原以ELISA法测定了Hp感染的 慢性胃炎 及消化性溃疡病人、健康体检者和新生儿血清中的抗Hp-IgG抗体,结果表明:①B型胃炎及消化性溃疡病人的阳性率明显高于A型胃炎及健康体检组;②体检组中抗Hp-IgG阳性率随着年龄组的增长而升高,30岁~50岁组达最高峰,70岁以上又稍有下降,③新生儿组抗Hp-IgG阳性率反比1/2岁~10岁年龄组为高,接近成人水平。其抗体可能通过胎盘来自母体中,提示Hp是后天获得感染。上述人群中,抗Hp-IgG抗体水平调查的结果又增强了慢性胃病的Hp感染之说。

1987年我们微生物学教研室以“弯曲菌样细菌(Campylobacter-like organisms,CLOS)的生物学地位及致病物质的研究”课题名称申请得到国家自然科学基金的资助。由此对Hp的生物学性状作了比较全面系统的研究,企图对Hp的生物学地位及致病机理作一些探讨。

1 材料和方法

1.1 材料

①标本1985年5月~1989年10月分别取自上海市仁济医院、纺二医院、新华医院有上消化道主述病人的内窥镜检查标本。②菌种Hp均分自病人。除药敏试验和与空肠弯曲菌的交叉反应者外,都以88065,88073,88082,88109,88152五个菌株作为代表进行试验研究。

参考菌种:空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,CJ)CJ-3276株和结肠弯曲菌F(Campylobacter coli,CC)CC-3278株由法国Borbeaux儿童医院Megraud 博士惠赠,空肠弯曲菌CJ-S131由苏州医学院微生物学教研室提供。胎儿弯曲菌(Campylobacter fetus,CF)日本大阪大学微生物学研究所三轮谷俊夫教授惠赠。

1.2 方法

1.2.1 光学显微镜检查 取胃粘膜活检标本或菌种培养物在洁净玻片上涂薄膜。自然干燥,加热固定,革兰染色后油镜检查。另取胃粘膜活检标本作石蜡包埋切片,四苯胺兰(touidine blue)染色镜检。

1.2.2 分离培养 空肠弯曲菌选择性基础琼脂(上海市卫生防疫站生产)中补充以10%羊血和1%可溶性淀粉,并每1000ml培养基中加入1ml万古霉素(10mg/ml),1mlTMP(5 mg/ml)和1mloctidione(5 mg/ml)制成平板后,置Queue三气培养箱(美国产),气体调节至5%O2,85%N2和10%CO2,37°C培养3d后观察。

  1.2.3 生化鉴定 主要参考 Cliodna等方法:①氧化酶反应 用竹签挑取血平板上可疑菌落至已被1%盐酸二甲基对苯二胺(E.Mer-ck,Darmstadt产品)溶液浸透、并预先干燥过的滤纸上,10s内出现深紫红色为阳性。②触酶反应 用含3%H2O2液的毛细玻管碰触血平板上菌落,有气泡升起为阳性。③尿素酶反应 将含有菌落棉拭插入尿素肉汤中,30s内棉拭呈粉红色为阳性。④DNA酶试验 在含有甲葳胺兰核酸琼脂的平皿上打孔后,将细菌悬液加于孔中,37°C培养2h后观察结果。小孔周围出现透明小圈者为阳性。⑤碱性磷酸酶反应 用0.02mol/LpH8.0Tris-HCL洗下细菌菌落。加入0.5ml1%磷酸对硝基苯脂(Beckman产品),37°C水浴1 h ,观察结果。呈黄色者为阳性。⑥亮氨酰胺肽酶反应 取小试管2只,1只测定管加待测菌液(约3×1010cfu/ml)0.05ml,另1只空白对照管加H2O0.05ml。然后各加0.2M磷酸缓冲液(pH7.2)0.45ml和基质液(亮氨酰-β-萘胺盐酸20mg溶于H2O25ml,加入0.2mol/LpH7.2的磷酸缓冲液25ml,充分混匀)0.5ml。37°C水浴30min后各加入40%三氯醋酸0.2ml。充分混匀后4000r/min离心沉淀10min。从测定管和空白对照管中各取上清液0.5ml分别装入另2只试管中,并分别加2NHCI0.5ml和0.2%NaNO20.5ml。充分混匀,室温(20°C)中静置10min。再各加0.5%氨基磺酸胺10ml。混匀后,室温(20°C)静置10min 。最后各加N-萘乙烯二胺二盐酸盐溶液[称取N-(1-萘)乙烯二胺二盐酸(分析纯,瑞士,Lichtemptindicht生产)100mg,溶于95%乙醇200ml中,冰箱保存可稳定1个月。临用时,以95%乙醇稀释10位后使用] 2.0ml。20min后观察结果。呈紫色为阳性。⑦马尿酸盐水解试验 接种1环48hCJ/CC培养物或72hHp培养物于0.4ml含1%马 尿酸盐水溶液的小试管中,混匀,放置37°C水浴2h,再轻轻倒入0.2ml茚三酮 试剂 (3.5g茚三酮溶于100ml丙酮:丁醇=1:溶液)于各管。置37°C水浴,经 10min后看结果。深紫色为阳性反应。

1.2.4 抗菌药物敏感性试验 用琼脂稀释法测定13种抗菌物(青霉素G、链霉素、庆大霉素、红霉素、先锋霉素V、四环素、痢特灵、灭滴灵、TMP、洁霉素、次硝酸铋、多粘菌素B、万古霉素)对30个(Hp)菌株(Hp菌株号:85025,85084,85114,85117,85120,85143,85187,85485,85507,85508,85524,85553,85558,85560,85562,85568,85596,85595,85621,85623,85625,85629,85634,85639,85643,85647,85648,85660,85663,85677)的最小抑菌浓度(Minimal inhibition Concentration,MIC)。①菌液准备:待测菌株落分别用生理盐水洗下,比浊调整至108fu/ml。②药敏平板制备:分别取200ul不同种类、不同浓度的抗菌药物稀释(抗菌药物的浓度为0.05μg~100μg/ml的对倍稀释液的对倍稀释系列)置于空的无菌平皿(φ9 cm)中。每只平皿加入加热融化的血琼脂10ml,轻轻摇动使培养基与抗菌药物均匀混合。待琼脂凝固后备用。③细菌拉种:用多点接种器(M2T-P)将菌液点种于上述每只药皿平板上。每个平板点种25个菌种。置微需氧环境中培养3d后观察结果。如Hp在某个抗菌药物浓度的培养基上生长,而在前一个大一倍的尝试的培养基上不长,则以此前一个平板中的抗菌药物尝试为该菌的MIC。

  1.2.5 菌种保存 挑取3~5环分纯的Hp菌种(菌号:88064,88065,88073,88075,88077,88082,88099,88108,88109,88152,88223,85289,85682,85688)于装有灭菌脱脂牛奶的Eppendorf塑料 离心管 ,置-70°C冻存。经1年后复苏鉴定。

1.3 超微结构的研究

以Hp88065,88073,88082,88109,88152菌株及CJ-3276,CJ-131、CC3278参考菌株制成负染和超薄切片,置H-500透射电镜下观察。取新鲜采集的胃粘膜活检标本经固定后在临界点下干燥,真空涂金。在JEOL JSM0S40扫描电镜下观察。

1.4 Hp的DNA G+Cmol%与菌体脂肪酸组成测定

  1.4.1 细菌DNA中G+Cmol%含量的测定 主要参赞丁鉴等高压液相 色谱 测定。①Hp DNA的提取;将细菌悬液经4000e/min×15离心沉淀,用0.15mol/LnaCI-0.1M EDTA pH8.0 溶液(SE液)洗一次后,重悬浮于10mlSE液中。加溶菌酶,使终浓度为2%的SDS,放60°C水浴15min。用等体积酚/氯仿・异戊醇(体积之比为3/1)抽提二次后,再用等体积氯仿/异戊醇(体积之比为24/1)和等体积乙醚各抽提一次。水相在pH7.8,10mmol/L Tris-HCI,1mmol/L ED-TA中透析4°C过夜。透析后的抽提液中加入经100°C、15min处理的Rnase,使终尝试为200ug/ml,37°C,2h。加蛋白酶K,终尝试为200ug/ml,37°C轻摇2h。用等体积酚/氯仿(体积之比为1/1)和等体积氯仿・异戊醇各抽提一次。水相加NaCl和0.1M,溶解后,加入

         

 

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