FCM对外周白细胞的免疫荧光分析

 

第三节　FCM对外周白细胞的免疫荧光分析

外周血是临床检验中的重要标本。FCM分析外周白细胞的主要目的是了解各种白细胞的数目与分群情况。这些数字的变化与临床的某些疾病有一定的关系。近年来，由于多种识别白细胞膜表面抗原的单克隆抗体的发现，以及对这些单克隆抗体的直接或间接荧光标记物的出现，使得利用FCM的荧光组织化学分析获得被测细胞的多指标的更多、更准确的信息，这无疑对警觉临床和科研有很大帮助。本节　主要讨论有关外周血的白细胞的免疫荧光标记技术、数据分析及临床应用等方面的问题。

一、白细胞的免疫荧光标记技术

1．白细胞抗原下面给出世界卫生组织对白细胞抗原的统一命名，以及它们的分子量、对应的单克隆抗体及反应阳性的细胞（见表10-2）。

表10-2　WHO对白细胞分化抗原的命名

抗原 分子量 单克隆抗体 反应阳性细胞 CD ₁ P45/12 Leu ₆ ,T ₆ ,OKT ₆ 胸腺细胞、朗格罕细胞 CD ₂ P50 Leu ₅ B,T ₁₁ ,OKT ₁₁ E玫瑰花受体、T和NK细胞 CD ₃ P19-29 Leu ₄ ,T ₃ ,OKT ₈ T细胞 CD ₄ P55 Leu ₃ ,T ₄ ,OKT ₄ 协助―诱导T细胞，单核细胞 CD ₅ P67 Leu ₁ ,T ₁ , T ₁₀₁ T细胞、B细胞亚群，慢粒（淋巴性） CD ₆ P120 T ₁₂ T细胞 CD ₇ P41 Leu _9.3 A T，T―ALL ^a 和NK细胞 CD ₈ P32-33 Leu ₂ ,T ₆ ,OKT ₈ 抑制-细胞毒T细胞、NK细胞 CD ₉ P24 BA-2 淋巴细胞 白血病 相关抗原 CD ₁₀ P100 CALLA, J ₅ 粒细胞、前B白血病细胞 CD ₁₁ P170/95 CR ₃ /Leu ₁₅ ,OKM ₁ 单核细胞、粒细胞、NK细胞 　 　 MO ₁ T细胞亚群（C ₃ bi受体） CD ₁₅ LNFP-I LeuM ₁ 单核细胞、粒细胞、激活的T细胞 CD ₁₆ P50~70 Leu ₁₁ NK细胞、粒细胞（IgGFc受体） CD ₁₉ P95 Leu ₁₂ ,B ₄ B、CLL ^b 前B-ALL细胞 CD ₂₀ P35 Leu ₁₆ ,B ₁ B细胞 CD ₂₁ P140 CR ₂ ,B ₇ B细胞、C ₃ a受体细胞 CD ₂₂ P135 Leu ₄₁ B、CLL、和毛细胞白血病细胞 CD ₂₃ P45 Blast ₂ CD ₂₄ P45，P55 BA-1 B、CLL和前B-ALL细胞 CD ₂₅ P65 IL-2受体 数分裂因子激活的T细胞HTLV-I、II、感染细胞

a：急性淋巴细胞性白血病；b：慢性淋巴细胞性白血病。

2．样品的制备供FCM分析的样品是单细胞悬液，而且大部分样品都需经荧光染色。样品的制备方法大致有三种：①用荧光单克隆抗体染全血，随后溶解红细胞；②红细胞溶解后染色；③通过梯度离心法分离出单个淋巴细胞和单核细胞，再将之制成细胞悬液染色。

（1）全血染色后溶解红细胞：由于不少血液标本具有生物危害性，用此方法可以将染色、溶解、固定、分析几个步骤都在一个试管内进行，这样减少转换过程中的污染。而且此法比用梯度离心分离出单个核细胞更节　省时间。由于此法未将粒细胞去除，故在用FCM分析时，要注意排除粒细胞的干扰。

具体操作步骤如下：

①全血100～150μl，放入5ml试管，并用50～100μl PBS稀释，总体积为200μl。]

　　②荧光标记的单克隆抗体染色30min，4 ^℃ （或放于冰上）。单克隆抗体的浓度因不同来源差异很大，但为了使用方便，可按其说明书配成每次实验使用10μl。注意蔽光。

③用3～4μl冷BPS清洗。离心250×g（约每分钟1500转），5min，洗3次。注意每次用吸管将上清吸出，决不能倾倒去液！

④用2ml氯化铵液（配法见下）在室温下溶解红血球，约10min。若红细胞完全被溶解，溶液由混浊变到透明。注意溶解程度的掌握十分重要：若溶解过分，则导致白细胞上抗原被破坏，或者某些敏感的细胞死亡而导致比例的改变。若溶解不彻底，大量红细胞会影响对淋巴细胞的分析。这是因为淋巴细胞在分析图像上与红细胞群接近，在框出淋巴细胞群时，会把部分红细胞框定于淋巴细胞内。而红细胞溶解不足或过度在很大程度上影响着分析结果。

【氯化铵液的配制】

Tris―氯化铵1×氯化铵

　　0.16mol/L 　NH ₄ Cl 　　0.38g/100ml　 　90ml 　　0.16mol/L　　NH ₄ Cl

0.17mol/L 　Tris 　　2.06g/100ml 　　10ml　　0.17mol/l 　　Tris

pH值7.56 　　　　　　　　　　　　　　　　pH值7.2

⑤红细胞被彻底溶解，加入1ml PBS稀释的0.5%甲醛，立即离心，洗3次，条件同步骤③。加入甲醛的目的是尽早固定细胞和细胞上的抗原，避免有生物危害的标本到处污染。

　　⑥将染色完成的细胞悬浮于0.5～1ml的0.1%甲醛溶液内。置4 ^℃ ，蔽光，等待分析。经固定后的细胞在冰箱内可保存一周，这样对工作的安排会带来方便。

（2）红细胞被溶解后再对白细胞染色：此方法的优点是可以了解被染白细胞的数量以及存活率。但由于有时有些标本比较敏感，溶解红细胞后，还要经过多个染色步骤，这样容易造成抗原的丧失。此法具体步骤如下：

①室温下放入14ml氯化铵在15ml的试管里。

②加入0.5～1ml全血，混合3～5min。

③立即离心100～150×g，并用PBS洗2次。

　　④白细胞计数，注意存活率应在90%以上。做成每毫升含5×10 ⁶ 白细胞悬浮液。将细胞分配到5ml的试管，每试管0.2ml，即1×10 ⁶ 个细胞。

　　⑤荧光标记的单克隆抗体染色30min，4 ^℃ ，避光。抗体浓度配制如前所述。

⑥PBS洗3次后，用0.5%甲醛固定。方法如前。

（3）用Ficoll―Hypaque 梯度离心法分离出单个核细胞：用此法可以