DNA的聚合反应和DNA聚合酶

 

1957年，Arthur kornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶Ⅰ，(DNa polymerase Ⅰ,简写DNA polⅠ)后来又相继发现了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。(DNa polymerase Ⅱ，Ⅲ，简写DNA polⅡ,DNA polⅢ)实验证明大肠杆菌中DNA复制的主要过程靠DNa polⅢ起作用，而DNA polⅠ和DNA polⅡ在DNA错配的校正和修复中起作用。见表16－1。

图16－9　DNA聚合酶的作用

这种酶的共同性质是：①需要DNA模板，因此这类酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶(DNa dependent DNA polymerase, DDDP)。②需要RNA或DNA做为引物(primer)，即DNA聚合酶不能从头催化DNA的起始。③催化dNTP加到引物的3′�H末端，因而DNA合成的方向是5′→3′。图16-9。④三种DNA聚合酶都属于多功能酶，它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。由于DNA聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点，所以我们着重介绍DNa polⅠ的作用并指出另外二种DNA pol的特殊性：

1.DNA聚合酶Ⅰ：

DNA polⅠ是由一条多肽链组成，分子量为109KD。酶分子中含有一个Zn++，是聚合活性必须的。

大肠杆菌每个细胞中约有400个酶分子，每个酶分子每分钟在37℃下能催化667个核苷酸参入到DNA链中，用枯草杆菌蛋白酶可将此酶水介成两个片段，大片段分子量为76KD，通常称为klenow片段，小片段为34KD。大小片段具有不同的酶活性。

(1)DNA聚合酶的5′→3′聚合活性：

这是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸顺序，将互补的dNTP逐个加到引物RNA3′�H末端，并促进3′�H与dNTP的5′�O4形成磷酸二酯键，酶的专一性表现为新进入的dNTP必须与模板DNA碱基配对时才有催化作用，5′→3′聚合活性存在于klenow片段上(图16－9和图16-10)。

图16-10　DNA聚合酶催化的DNA链延长

(2)DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性：

这种酶活性的主要功能是从3′→5′方向识别并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对而游离的核苷酸，这种功能称为校对功能，这是保证其聚合作用的正确性不可缺少的，因此对于DNA复制中极高的保真性是至关重要的。

(3)DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性：

这种酶活性是从DNA链的5′端向3′末端水解已配对的核苷酸，本质是切断磷酸二酯键，每次能切除10个核苷酸。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起重要作用，对完成的DNA片段去除5′端的RNA引物也是必须的。

DNA polⅠ的5′→3′聚合活性和5′→3′外切酶活性协同作用，可以使DNA一条链上的切口从5′→3′方向移动，这种反应叫做缺刻平移(nick translation)，利用此反应可在体外对DNA片段进行放射性磷(α-32PdNTP)的标记制成探针(probe)，进行核酸的分子杂交实验，是现代分子生物学的一项重要技术(图16－11)。

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�图16-11　缺刻平移标记DNA探针

许多实验证实DNA polⅠ并不是DNA复制过程中的主要酶，它的作用主要与DNA损伤后的修复有关。

2.DNA聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ)

此酶分子量为120KD，每个细胞约有100个酶分子，但活性只有DNa polⅠ的5%，它具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，而没有5′→3′外切活性，它的作用可能与DNA损伤修复有关。

3.DNA聚合酶Ⅲ(DNA polⅢ)

图16－12　DNA聚合酶Ⅲ催化先导链和随从的合成

这是在DNA复制过程中起主要作用的聚合酶，它是由一个多亚基组成的蛋白质分子，其分子量＞600kDa整个酶分子形成一个不对称的二聚体，每个大肠杆菌细胞中只有10?0个酶分子，但催化dNTP参入DNA链的速率却是最快的，约为9000核苷酸/每分钟/每个酶分子。这也证明DNa polⅢ是DNA复制过程中主要发挥作用的酶。在大肠杆菌染色体DNA进行复制时，DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是单独起作用的，而是与引发体，介链酶等构成一个复制体(replisome)。由于复制体的存在，先导链和随从链可以同时复制。DNa polⅢ是由多亚基组成的不对称二聚体，它可能同时负责先导链和随从链的复制，在φ×174的复制中观察到引发体总是伴随着DNA噜噗(loop)的存在。图16?2可以看到，由于随从链的模板DNA在DNA聚合酶Ⅲ全酶上绕转了180°而形成一个噜噗，因此岗崎片段的合成方向能够与先导链的合成方向以及复制体移动方向保持一致。

随着DNA polⅢ向前移动，先导链的合成逐渐延长的同时，岗崎片段也在不断延长，这一噜噗也在不断扩大。当岗崎片段合成到前一个片段的5′端时，这一大噜噗就释放出来，由于复制叉向前移动又可将另一部分随从链的模板置换出来，由引发体合成新的引物，然后再形成一个小的噜噗，进行新的岗崎片段的合成。由此模型不难看出：随从链的合成需要周期性的引发，因此其合成进度总是与前导链相差一个岗崎片段的长度。岗崎片段完成后，其5′端的RNA引物由DNa polⅠ的5′→3′外切酶活性切除，由此造成的空隙再由DNA polⅠ的5′→3′聚合活性催化dNTP得到填补。所以DNA的复制是在DNa polⅢ和DNA polⅠ互相配合下完成的。

下面列表说明三种大肠杆菌DNA聚合酶的特性�

表16－1　大肠杆菌DNA聚合酶特征�

	DNA聚合酶Ⅰ	DNA聚合酶Ⅱ	DNA聚合酶Ⅲ
分子量	109KD	120KD	＞600KD
每个细胞中的分子数	400	17-100	10-20
5′→3′聚合活性	+	+	+
37℃转化率核苷酸数／酶分子・分钟	600	30	30,000
5′→3′外切活性	+	-	-
5′→3′外切活性	+	+	+
切刻平移活性	+	-	-
对dNTP亲和力	低	低	高
功能	修复	不详	复制
去除引物
填补空缺

真核生物DNA聚合酶

真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε。它们的基本特性相似于大肠杆菌DNA聚合酶，其主要活性是催化dNTP的5′→3′聚合活性，基本特征见表16－2。�

表16-2　真核生物DNA聚合酶

	α	β	γ	δ	ε
亚基数	4	4	4	2	5
分子量（KD)	＞250	36-38	160-300	170	256
细胞内定位	核	核	线粒体	核	核
5′→3′聚合活性	＋	＋	＋	＋	＋
3′→5′外切活性	－	－	－	－	－
功能	复制、引发	修复	复制	复制	复制

真核细胞在DNA复制中起主要作用的是DNA polα，主要负责染色体DNA的复制。DNa polβ的模板特异性是具有缺口的DNA分子，被认为它与DNA修复有关。DNa polγ在线粒体DNA的复制中起作用。DNA polδ不但有5′→3′聚合活性，而且还具有3′→5′外切酶活性，据认为真核生物DNA复制是在DNa polα和DNA polδ协同作用下进行的，前导链的合成靠DNA polδ催化，并且还需要一种细胞周期调节因子�鲋诚赴�丝乖?proliferating cell nucleus antigen, PCNA)参与。而随从链的合成靠DNA polα和引发酶配合作用完成。