材料与仪器
限制性内切核酸酶 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段 模板 DNA
乙酸铵 乙醇 dNTP 溶液
Sephadex G-50 离心柱 水浴
乙酸铵 乙醇 dNTP 溶液
Sephadex G-50 离心柱 水浴
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
乙酸铵(10 mol/L )
乙醇
2. 酶和缓冲液
适宜的限制性内切核酸酶
大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段
3. 核酸和寡核苷酸
含适当未标记的 dNTP 各 1 mmol/L 的 dNTP 溶液
模板 DNA ( 0.1~5 μg )
4. 放射性复合物
[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml,比活性为 800~3000 Ci/mmol)
5. 专用设备
Sephadex G-50 离心柱,用 TE ( pH 7.6) 平衡
预先设定至 75℃ 的水浴
二、方法
1. 在 25~50 μl 的适当的限制酶缓冲液内,用所需限制酶消化高达 5 μg 模板 DNA。
2. 向完成的限制酶消化反应中,加入:
10 mCi/ml [α-32P] dNTP
(比活性 800~3000 Ci/mmol) 2~50 μCi
未标记的 dNTP 至终浓度为 100 μmol/L
Klenow 片段 1~5 单位
室温温育反应 15 min。
3. 于 75℃ 加热 10 min 以终止反应。
4. 用 Sephadex G-50 离心柱层析分离放射性标记的 DNA 与未掺入的 dNTP 或在 2.5 mol/L 乙酸铵存在下进行两轮乙醇沉淀。
1. 缓冲液和溶液
乙酸铵(10 mol/L )
乙醇
2. 酶和缓冲液
适宜的限制性内切核酸酶
大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段
3. 核酸和寡核苷酸
含适当未标记的 dNTP 各 1 mmol/L 的 dNTP 溶液
模板 DNA ( 0.1~5 μg )
4. 放射性复合物
[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml,比活性为 800~3000 Ci/mmol)
5. 专用设备
Sephadex G-50 离心柱,用 TE ( pH 7.6) 平衡
预先设定至 75℃ 的水浴
二、方法
1. 在 25~50 μl 的适当的限制酶缓冲液内,用所需限制酶消化高达 5 μg 模板 DNA。
2. 向完成的限制酶消化反应中,加入:
10 mCi/ml [α-32P] dNTP
(比活性 800~3000 Ci/mmol) 2~50 μCi
未标记的 dNTP 至终浓度为 100 μmol/L
Klenow 片段 1~5 单位
室温温育反应 15 min。
3. 于 75℃ 加热 10 min 以终止反应。
4. 用 Sephadex G-50 离心柱层析分离放射性标记的 DNA 与未掺入的 dNTP 或在 2.5 mol/L 乙酸铵存在下进行两轮乙醇沉淀。
来源:丁香实验