用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段标记合成的寡核苷酸

在某些情况（例如用寡核苷酸作Southern印迹杂交的探针）下，重要的是要将寡核苷酸标记至尽可能高的放射性比活度。磷酸化反应最多能使每一寡核苷酸分子中掺入一个32P原子。但用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段3合成与合成寡核苷酸互补的DNA链， 则可得到比活度更高探针（Studencki 和Wallace，1984;Ullrich等，1984b）。用一短引物与寡核苷酸模板结合，后者的序列互补于所用的放射性标记探针。 该引物后在大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段的作用下延伸，从而使[γ－³² P]dNTP在模板指导下发生掺入。反应后，通过对模板和产物进行变性继而通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳交将它们分开。用这种方法，有可能生成这样一种寡核苷酸探针，即每一寡核苷酸分子带有若干个放射性原子。其放射性比活度可高达2x10¹⁰ 计数/（分．mg）。对该法进行改进后，可以由两段3'端含互补序列的寡核苷酸合成更长的探针（Ullrich等，1984a）。
在准备进行这些类型的反应时，务必考虑以下几点：

    （1） 反应中[α-32P]dNTP的比活度 α－磷酸已完全被³² P置换的一个dNTP分子的比活度大约为9000Ci/mmol。比活度更低的制品所含的是³² P标记的和未标记的分子混合物。这样，假如用比活度为3000Ci/mmol的单种d NTP参与合成反应，同时该种核苷酸在混合物中的可掺入位置又只有3个，那么每个探针分子应将平均只带上一个³² P 原了（即其比活度将约等于用T4噬菌体多核苷酸激酶标记的探针）。如果知道目标探针的序列和得前体的比活度，应有可能预计当1种、2种、3种和全部4种dNTP掺入反就时所得的探针的比活度。

    （2） 反应中dNTP的浓度 反庆中每种d NTP的浓度应不低于1μmol/L，否则核苷酸的聚合就无法有效地进行。所以。至关重要的是要确保在反应进行的过程中底物浓度不降至1μmol/L（约0.66ng/μl）以下， 应根据板应中所有的单链序列全部作用模板这一假设来计算可掺入探针的每种dNTP的总量。 反应中每种dNTP的总量应为可掺入探针的量加上0.66ng/μl所得的和。

    （ 3） 引物的长度和特异性 引物必须有足够的长度的特异性，以便能与模板结合并在适当位置上启动合成。用于本用途的引物通长7－9个核苷酸，并与模板寡核苷酸3'端或紧邻3'端的序列互补。由于难以预测中短杂交体的稳定性，故应有着手大规模反应之前，通过实验确定引物与模板间的比例应为多少才能使探针的产量最大。

     （4） 终产物的长度 终产物是与模板等长或比模板稍短（这主要取决于与引物互补的序列在模板上的位置）的双锭DNA片段，为了尽可能得到最有效的探针，必须将非标记模板链从放射性标记的互补产物中有效地分离出去，否则两长互补链将互相退火，从而遏制与所需要的靶序列的杂交。对于短于30 个核苷酸， 进行19％聚丙稀酰胺凝胶电泳是分离互补链的最为有效的方法。如果两长链长度再稍有不同。则分离效率不可以更高，所以，应当说可能将引物设计成与模板上毗今最末端的核苷酸互补。假如引物与模板3'端2－3个核苷酸不能杂交， 那么放射性标记引物应会比非标记的模板短一些，通过电泳进行分离的效率也就更高。不过，即使模板与产物的长度相同，两者在电泳过程中仍然极的可能得到一定程度的分离。因为单链核酸在凝胶中的迁移率不仅取决于链长，而且也取地碱基组成和序列。在合成探会之前用无放射性的ATP将两针链之一（模板或引物）磷酸化 ， 或者通过保留连在引物5' 端的二甲氧三苯甲基（Studencki和Wallace，1984），通常还可以提高分离程度。 由于我们不呆能预料究竟何种方法对于某一特定的寡核苷酸最为有效，因此通常有必要进行一系列预实验，以确定在各种情况下产物与模板分离的效率。

    1） 在微量离心管中将[α－³² P]ATP混匀， 依据能使比活度达到要求和足以在所有模板链上进行全长合成的需要来计算[α－³² P]ATP的量。切记dNTP深度在反应的任何阶段都不得于1μmol/L。为保证诸试剂的浓度足够高，应以尽可能小的体积进行反应。 所以最好使用保存于醇－水溶液中供应的放射性标记dNTP作底物， 而不用以水性缓冲液为供应者。适当体积的[α－³² P] ATP的乙醇溶液既可在作反应用的离心管中进行混合。，又能在管中蒸发至干。

    2） 向离心管内加入适量的引物和模板DNA。为保证引物能够有效地引导反应，其摩尔数应过量，达到模板的3-10倍。

   3） 加0.1体积的10xKlenow缓冲液。充分混匀。
10xKlenow缓冲液
0.4mol/L磷酸钾（pH7.5）
66mmol/L MgCl2
10mmol/L β－巯基乙醇

    4） 按每5反应体积2－4单位加入大肠杆菌DNA聚合酶IKoenow片段。充分混匀。

     5） 用等体积的凝胶加样缓冲液将反应稀释，并于80℃加热3分钟，随后将全部的反应液加样至变性聚丙烯酰胺凝胶（即加7mol尿灌制者）。
凝胶加样缓冲液
80％（W/V） 甲酰胺
590mmol/L Tris-硼酸（pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
0.1％(W/V)溴酚蓝
甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理；并用Whatman1号滤纸过滤2次。去离子甲酰胺分装成小体积，充氮存于－70℃。按照反应混合液中寡核苷酸大小的不同，用于制胶的聚丙烯酰胺的浓度和电泳条件也不相同。下表列出一些在常用的提示

聚丙烯酰胺凝胶通常用1xTBE（89mmolk/L Tris-硼酸、2mmol/L EDTA）灌制，电泳亦在相同缓冲液中进行。
     6） 电泳结束后，卸下电泳装置，将其中一面玻璃板与凝胶分开。小心：未掺入的[α－32P]ATP可能已迁移至下槽缓冲液中而使之具有放射性！ 将凝胶及其背面的玻璃板裹于Saran包装膜内。记下示踪染料的位置，用手提式小型探测器在凝胶上应含有寡核苷酸的部位检测放射性活度值。将一组涂有放射性墨水的粘性圆点标签纸围绕品的同边粘贴在Saran包装膜上，用Scotch胶带将圆点标签纸覆盖，以防放射性墨水法染X光片夹或增感屏。交凝胶对放射自显影底片进行曝光，掺入探针的放射性相当高，数分钟仙即可在胶片上得到影像。利用上述方法中圆点标签上的放射性标记定出凝胶中探针的位置。切下条带，方法回收放射性标记寡核苷酸。放射性墨水系上少量32P与防水的黑色绘图墨水混合而成。为方便起见，我们将这种墨水分为3级：极热级（>2000计数/秒，据手提式小型探器）、热级（500-2000计数/秒，据手提式小型探测器）和冷级（50-500计数/秒， 据手提式小型探测器）。用一纤维尖笔将所要求等级的墨水涂在粘性标签纸上。应在该纤维尖笔上贴上放射性物质的专用提示胶带，妥善保管。