原理
本方案以 poly(A) + RNA 作为模板，通过随机引物反应合成 cDNA 探针，这类探针可用于 cDNA 文库的差异筛选。
材料与仪器
反转录酶 反转录酶缓冲液 随机脱氧核苷酸引物 模板 mRNA
乙酸铵 DTT EDTA 乙醇 HCl NaOH 酚 氯仿 胰 RNA 酶抑制剂 SDS Tris-Cl dNTP 溶液
冰水浴 Sephadex G-50 离心柱 水浴或加热板
乙酸铵 DTT EDTA 乙醇 HCl NaOH 酚 氯仿 胰 RNA 酶抑制剂 SDS Tris-Cl dNTP 溶液
冰水浴 Sephadex G-50 离心柱 水浴或加热板
步骤
一、材料
1. 缓冲液与溶液
乙酸铵（10 mol/L）
DTT (1 mol/L)
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
HCl ( 2.5 mol/L)
NaOH ( 3 mol/L)
酚：氯仿（1:1，V/V）
胰 RNA 酶抑制剂（20 单位/μl )
SDS ( 10% m/V)
Tris-Cl ( 1 mol/L，pH 7.4)
2. 酶和缓冲液
反转录酶
10X 反转录酶缓冲液
3. 核酸与寡核苷酸
含有 dATP、dGTP 和 dTTP 各 20 mmol/L 的 dNTP 溶液
dCTP ( 125 μmol/L)
长度为六或七个碱基的随机脱氧核苷酸引物
模板 mRNA
4. 放射性化合物
[α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml，比活性为 >3000 Ci/mmol)
5. 专用设备
冰水浴
Sephadex G-50 离心柱，平衡于 TE（pH 7.6）
预热至 45℃、68℃ 和 70℃ 的水浴或加热板
二、方法
1. 将 1 μg poly(A)+RNA 转移至消毒的微量离心管。用无 RNA 酶的水将溶液的体积调至 4 μl。盖紧微量离心管盖，于 70℃ 加热 5 min，然后迅速将离心管转至冰水浴中。
2. 在微量离心管的冷溶液中加入：
10 mmol/L DTT 2.5 μl
胎盘 RNA 酶抑制剂 20 单位
随机脱氧寡核苷酸引物 5 μl
10X 反转录缓冲液 2.5 μl
20 mmol/L dGTP、dATP 和 dTTP 溶液 1 μl
125 μmol/L dCTP 溶液 1 μl
10 mCi/ml [α-32P] dCTP
( 比活性为 > 3000 Ci/mmol) 10 μl
无 RNA 酶的水 加至 24 μl
反转录酶（200 单位） 1 μl
3. 加入下列试剂以终止反应：
0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0) 1 μl
10% （m/V）SDS 1 μl
充分混合管中的试剂。
4. 在反应管中加入 3 μl 3 mol/L NaOH，68℃ 温育混合物 30 min 以水解 RNA。
5. 使反应混合物的温度冷却至室温，加入 10 μl 1 mol/L Tris-Cl（pH 7.4）以中和溶液，混匀，然后加入 3 μl 2.5 mol/L HCl。取极小量液体滴在 pH 试纸上，以检测溶液的 pH。
6. 用酚：氯仿抽提纯化 cDNA。
7. 用离心柱层析或在 2.5 moI/L 醋酸铵存在下用乙醇选择性地沉淀放射性标记的探针以与未掺入的 dNTP 分离。
8. 用三氯乙酸（TCA）沉淀法或 DE-81 滤膜结合法来确定放射性标记 dNTP 掺入的比例。
1. 缓冲液与溶液
乙酸铵（10 mol/L）
DTT (1 mol/L)
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
HCl ( 2.5 mol/L)
NaOH ( 3 mol/L)
酚：氯仿（1:1，V/V）
胰 RNA 酶抑制剂（20 单位/μl )
SDS ( 10% m/V)
Tris-Cl ( 1 mol/L，pH 7.4)
2. 酶和缓冲液
反转录酶
10X 反转录酶缓冲液
3. 核酸与寡核苷酸
含有 dATP、dGTP 和 dTTP 各 20 mmol/L 的 dNTP 溶液
dCTP ( 125 μmol/L)
长度为六或七个碱基的随机脱氧核苷酸引物
模板 mRNA
4. 放射性化合物
[α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml，比活性为 >3000 Ci/mmol)
5. 专用设备
冰水浴
Sephadex G-50 离心柱，平衡于 TE（pH 7.6）
预热至 45℃、68℃ 和 70℃ 的水浴或加热板
二、方法
1. 将 1 μg poly(A)+RNA 转移至消毒的微量离心管。用无 RNA 酶的水将溶液的体积调至 4 μl。盖紧微量离心管盖，于 70℃ 加热 5 min，然后迅速将离心管转至冰水浴中。
2. 在微量离心管的冷溶液中加入：
10 mmol/L DTT 2.5 μl
胎盘 RNA 酶抑制剂 20 单位
随机脱氧寡核苷酸引物 5 μl
10X 反转录缓冲液 2.5 μl
20 mmol/L dGTP、dATP 和 dTTP 溶液 1 μl
125 μmol/L dCTP 溶液 1 μl
10 mCi/ml [α-32P] dCTP
( 比活性为 > 3000 Ci/mmol) 10 μl
无 RNA 酶的水 加至 24 μl
反转录酶（200 单位） 1 μl
3. 加入下列试剂以终止反应：
0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0) 1 μl
10% （m/V）SDS 1 μl
充分混合管中的试剂。
4. 在反应管中加入 3 μl 3 mol/L NaOH，68℃ 温育混合物 30 min 以水解 RNA。
5. 使反应混合物的温度冷却至室温，加入 10 μl 1 mol/L Tris-Cl（pH 7.4）以中和溶液，混匀，然后加入 3 μl 2.5 mol/L HCl。取极小量液体滴在 pH 试纸上，以检测溶液的 pH。
6. 用酚：氯仿抽提纯化 cDNA。
7. 用离心柱层析或在 2.5 moI/L 醋酸铵存在下用乙醇选择性地沉淀放射性标记的探针以与未掺入的 dNTP 分离。
8. 用三氯乙酸（TCA）沉淀法或 DE-81 滤膜结合法来确定放射性标记 dNTP 掺入的比例。
来源：丁香实验
