无菌动物技术

 

四、无菌动物技术

无菌动物在自然界并不存，必须用人为的方法养育而成。一般将临产前的健康动物用麻醉药品或拉断颈椎处死后，立即浸泡在37℃灭菌液中，送进无菌室（或无菌隔离器），按无菌手术进行剖腹，切除带胎子宫（子宫内首先应无菌），将其浸入消毒液里并立即输送到另一只隔离器中，切开子宫取胎，经用灭菌纱布揩拭仔体并断脐（电刀切断）后，放入隔离器内人工喂乳或用其他品系的无菌雌鼠作保姆代养。象小鼠和大鼠等用人工喂乳非常麻烦，故采用保姆代养。而象豚鼠因在一定程度上能自力饮乳，故人工哺乳较容易。另外，象禽类、鱼类、昆虫类等，因是在卵中无菌的前提下作出的，故用药物将卵周围灭菌后移入灭菌隔离器内使其孵化即可，而且，这些动物，一般在出生后就能自力采食，故较易育成。

无菌动物的理论基础和实践依据在于胎盘屏障和屏障观念，根据这个基础开展了无菌动物工作。在无菌条件下取仔，一切操作在无菌隔离器内进行。

（一）哺乳类无菌动物技术

小动物作子宫切除术（Hysterectomy）；大动物做子宫切开术（Hysterotomy）获得幼仔。子宫切开对兔子可用三次，但易污染，不如子宫切除术取仔安全。大动物主要从经济角度考虑，采用子宫切开取仔术。取仔程序如下：

1．腹部剃毛或用硫化钠脱毛剂脱毛。

脱毛剂配制：

硫化钡 50克

湿润剂 4克

甘油10克

水50毫升

作成类糊状用以脱毛。

2．处死妊娠雌鼠。一般不用化学药品处死，以兔影响胎鼠。如用化学药品时，应使剂量对胎体无影响时方可使用。一般对小鼠用断颈髓处死。较大的动物如豚鼠用氟烷（Halothane Oxygen）吸入麻醉，不用乙醚麻醉。

3．处死的雌鼠浸泡于37℃灭菌液中2分钟。灭菌液配制：

福尔马林20%

季铵5%

苄烷氨水75%

4．将妊娠鼠固定住，并于腹部粘上灭菌胶布。

5．剖腹。

6．取出子宫：

⑴将子宫放入灭菌液中，之后将盛子宫的小筐递到另一隔离器中取胎鼠。这样，在隔离器中有充分的时间检查其是否污染。

⑵如将子宫直接在无特定病原体条件下取胎和饲养则有危险，可能受染而无机会观察。

7．用剪刀剪开子宫壁，取出胎鼠，轻按以帮助呼吸，不立即断脐，待呼吸正常时再用电刀切断脐带。

8．分开胎盘，将取出的幼仔放到代乳母鼠身边，把代乳母鼠的幼仔取出与剖腹产取出的幼鼠接触，使之有同样的气味，便于代养。

9．剖腹取胎的时限。

⑴小鼠、大小：9-10分钟；

⑵豚鼠：5分钟，因豚鼠耐缺氧能力低弱。

乳汁制备：首先用挤奶机获得兔奶，冷冻干燥，经γ射线消毒，保存于塑料袋中，贮放在隔离器内。需用时将奶粉加水恢复干燥前的浓度，不加维生素和其他成份。须注意人工喂养经常出现因灌喂入肺而致死。家兔3次/日，后来发现1次/日即可。根据家兔年龄及体重考虑每两日加量1次。第1天喂5毫升，可维持1次/日；以后逐渐增加到4-5次/日；第3周时即可吃饲料。

自1958年以来，小鼠不用人工喂养。Sabourdy开始培育无菌小鼠时，每天喂5次，有时半夜去喂小鼠，实际上无此必要。自广泛使用隔离器后，都靠代乳鼠喂养。Sabourdy还认为中国如开始培育无菌动物工作，不必采用人工喂养，因现在各国有许多实验动物中心有无菌动物，运输也方便，可以从他的或别的实验室引进代乳鼠。

代乳鼠的最适期：在隔离器中交配，约于部腹服胎前1-2天产仔。C3H和C57BL品系为常用的代乳鼠。用作手术取胎的母鼠最好不是第一胎的。一般用做交配的雄鼠下午时放入，第二天上午8时将雄鼠取出。做剖腹产需了解雌鼠的妊娠期。特种鼠的妊娠期取足月的。小鼠性周期为4天多，如用100只雌鼠交配，应有25只雌鼠受孕，实际上若用10%已属不错。如果10只雌鼠受乳，用Whitten氏反应法，100只雌鼠可有30%受孕。

（二）鸟类无菌动物技术

　　常用鹌鹑，也用鸡。研究营养用无菌鸡，要选育无 白血病 的鸡群。饲养无菌鸡比较容易。雏鸡出壳即可啄食，不用人工喂饲。关键在于消毒卵壳，因卵壳不平，不易灭菌。首先选外壳干净的受精卵。按以下程序进行：

1．将受精卵放至湿润剂中。

2．再放入2%升汞中浸12分钟。

3．将浸泡过的受精卵放入隔离器中孵育。

建立无白血病鸡群无从母鸡选起，用这种鸡卵培育无菌鸡。否则仅外壳消毒是消灭不了鸡白血病病毒。