用于检测植物组织RNA的原位杂交法1

用于检测植物组织 RNA 的原位杂交法

（一）组织切片制备

l      植物组织的甲醛固定和包埋

1．将植物组织切成小块，立即放入一个装有10～50ml固定剂溶液的烧杯中，把烧杯放到真空脱水机内。调节真空度以形成一个温和的真空，然后慢慢恢复常压。微量便于固定剂渗入组织，必须反复真空和非真空状态。待固定剂充分渗入组织块后，室温下放置2～3小时。

2．室温下用50～100ml 50mmol/L PIPES缓冲液（pH6.8）漂洗组织块20分钟。

3．室温下将组织块先后放在不同稀释度的乙醇水溶液（25％，50％，75％和100％）中脱水。每个梯度取50～100ml，各培养20分钟。4℃下用50～100ml 100％乙醇培育组织块，脱水过夜。温和的摇动或搅动可以促进组织中溶剂的交换。

4．第二天上午，将组织块转移到50～100ml新的100％乙醇中。再脱水30分钟。

5．室温下用不同稀释度的二甲苯乙醇溶液（25％，50％，75％和100％）先后浸渗组织块。每个梯度取用50～100ml，各培育60分钟。在100％二甲苯中重复培育2次。

6．在60℃下用不同稀释度的Paraplast Plus^TM 二甲苯溶液（25％，50％，75％和100％）先后浸渗组织块。每个梯度取用50～100ml，各浸渗2小时。60℃下用100％Paraplast Plus^TM 温育组织块，浸渗过夜。在60℃温育过程中，我们发现水浴加热比在电炉上直接加热更能维持一个稳定的温度。水浴加热时，必须将放置组织块的烧杯严密封口以防止水汽渗入正在包埋的介质中。

7．至此，组织块可以包埋在Paraplast Plus^TM 块中了。为了制备包埋块，首先将机械模具放在载片加热仪上，温度设置在60℃。避免过分加热。在模具中倒入熔化的Paraplast Plus^TM ，将组织块转移到模具内。用一根细菌接种针安排好它们的位置，然后加入更多熔化了的Paraplast Plus^TM 。在模具中插入合适的附架。为了确保Paraplast Plus^TM 冷却后附架的稳固性，可以再添加一些熔化的Paraplast Plus^TM 。将模具转移到实验台上使其慢慢冷却。在切片前包埋块可以保存在模具中。

8．从模具中取出包埋块之前，将模具紧紧贴在冰上，使金属模具收缩5～10秒。然后用刮刀将蜡块撬出。

 

l     显微镜载玻片的准备

1．把所需数量的显微镜载玻片放入一个载玻片固定器，浸入Chromerge^TM ，室温下过夜。

2．从Chromerge^TM 中取出载玻片，在流水中洗涤3小时。然后用蒸馏水冲洗，铝箔包裹后180℃烘烤过夜。

3．包被。把载玻片浸入含2％TESPA的丙酮溶液5～10秒。迅速用丙酮洗涤两次，再用蒸馏水冲洗一次，然后空气干燥。用TESPA包被后载玻片可以保存几个月。

 

l     植物组织的封固和切片

1．在一个耐热玻璃盘中倒入大约1L的组织切片粘合剂，放入45℃水浴加热。

2．用一个锋利的单边剃刀，修去包埋组织边缘多余的蜡。切痕应该呈长方形，表面光洁。修去由模具产生的圆形边缘。确保包埋块上下边缘平行。修块时将包埋块锁定在切片机的卡盘中，使修整过的平行边缘位于包埋块的顶部和底部。

3．从包埋块上切下一条切片条，每个切片的厚度约为8～10μm。用湿润的指尖和小画刷将切片（光亮面向下）转移到耐热玻璃盘的组织粘合剂中。切片在溶液中漂浮2～3分钟后，用载玻片提起。在磨砂边缘处拿着载玻片，以近垂直的角度浸入溶液中。使切片条中两个切片结合处与载玻片的边缘相平。载玻片轻轻向切片移动，碰到切片后温和提起。经过一些操作实践比较有经验后，提起载玻片时可以将一个单独的切片从切片条中分离出来。从切片条中分离和提起单个切片时，用画刷保持切片条的稳定。如果要在载玻片上调整切片的位置，可以将载玻片再次浸入粘合剂中，重新漂浮切片，仍以近垂直的角度拿着载玻片，对着载玻片用画刷放置好切片，然后从粘合剂中温和地提起载玻片。

4．在温育箱中，将载玻片竖立，42℃干燥过夜。

 

（二）RNA 探针的合成

l     制备线状的DNA 模板

1．选用合适的限制性内切酶（50～100 units），酶解10～20μg质粒。反应液的总体积约为200μl，37℃保温2小时。

2．在质粒的酶解液中加入等体积（200μl）的苯酚/氯仿（1：1），抽提线状DNA。温和地漩涡振荡试管，混匀。离心分层，将上层的水相转移到一个干净的试管中，进行第二次苯酚/氯仿抽提。

3．取出水相，用等体积的氯仿抽提两次。

4．沉淀DNA片段。加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积冰冷的100％乙醇，－20℃下放置1小时。12 000g离心10分钟。

5．将DNA重新溶解于Tris/EDTA（pH7.6），调节溶液量使DNA的终浓度约为1.0μg/μl。

6．测量260nm和280nm处的光吸收值，确定DNA浓度。一个OD₂₆₀ 单位对应约40μg/μl的双链DNA，OD₂₆₀ /OD₂₈₀ 的值应为1.8左右。

7．取0.5μgDNA，在小型电泳槽上进行电泳，检查酶解是否完全。

 

l     DNA 模板的转录－生成高度专一活性的RNA 探针

1．配制下列反应溶液：

H₂ O                                      4μl

转录缓冲液（5×）                         5μl

DTT（0.1 mol/L）                         2.5μl

RNA酶抑制剂                           1.25μl

ATP（10mmol/L）                        1.25μl

CTP（10mmol/L）                        1.25μl

GTP（10mmol/L）                        1.25μl

UTP（500μlmol/L）                         1μl

DNA模板（1μg/μl）                      2.5μl

³⁵ S－UTP（1200Ci/mmol）                    5μl

总体积                                    25μl

为了避免亚精胺引起引起DNA沉淀，应在室温下添加各种试剂（聚合酶除外，见步骤3）

2．从反应溶液中取出1μl，加入1ml H₂ O中。将此样品标记为t₀ ，保存在冰中备用。后面将用它计算RNA探针的合成量。

3．在反应溶液中加入1μl聚合酶T7或SP6，总体积为25μl。40℃温育45分钟。

4．从反应溶液中取出1μl，加入1ml H₂ O中。将此样品标记为t₄₅ ，保存在冰中备用。后面将用它来计算RNA探针的合成量。

5．在剩下的反应溶液中（24μl），按1μg DNA模板一个单位的比例加入无RNA酶活性的DNA酶。37℃温育10分钟。

6．加入2μl浓度为10μg/μl的tRNA载体。用苯酚/氯仿抽提一次，再用氯仿抽提一次。

7．加入3mol/L 的乙酸钠（pH6.0）至终浓度为0.3mol/L，再加入2倍体积预先冰浴的100％乙醇，沉淀RNA。－20℃下放置1小时。

 

l     RNA 合成量的计算

1．取4个DE-81滤器，其中两个分别加上10μl t₀ 样品和t₄₅ 样品，作为一组；对另外两个进行同样的处理。取一组滤器，用500mmol/L Na₂ PO₄ （pH7.4）洗4此，每次5分钟；再用蒸馏水洗涤两次，每次5分钟；最后用95％乙醇洗。每一次洗涤大约消耗200ml洗涤液。将洗过的滤器干燥。用³ H＋¹⁴ C频道对所有滤器进行计数。

2．未洗的滤器代表每个样品中³⁵ S的总数，洗涤的滤器则表示掺入RNA的³⁵ S的数目。经过45分钟的反应，应该有大约70％的³⁵ S掺入RNA。

用于检测植物组织 RNA 的原位杂交法

（一）组织切片制备

l      植物组织的甲醛固定和包埋

1．将植物组织切成小块，立即放入一个装有10～50ml固定剂溶液的烧杯中，把烧杯放到真空脱水机内。调节真空度以形成一个温和的真空，然后慢慢恢复常压。微量便于固定剂渗入组织，必须反复真空和非真空状态。待固定剂充分渗入组织块后，室温下放置2～3小时。

2．室温下用50～100ml 50mmol/L PIPES缓冲液（pH6.8）漂洗组织块20分钟。

3．室温下将组织块先后放在不同稀释度的乙醇水溶液（25％，50％，75％和100％）中脱水。每个梯度取50～100ml，各培养20分钟。4℃下用50～100ml 100％乙醇培育组织块，脱水过夜。温和的摇动或搅动可以促进组织中溶剂的交换。

4．第二天上午，将组织块转移到50～100ml新的100％乙醇中。再脱水30分钟。

5．室温下用不同稀释度的二甲苯乙醇溶液（25％，50％，75％和100％）先后浸渗组织块。每个梯度取用50～100ml，各培育60分钟。在100％二甲苯中重复培育2次。

6．在60℃下用不同稀释度的Paraplast Plus^TM 二甲苯溶液（25％，50％，

l      RNA 剪切

1．12 000g离心10分钟沉淀RNA，去上清。用200～300μl 70％的乙醇洗RNA沉淀一次。待残留的微量乙醇挥发后，将RNA沉淀重新悬浮于50μl无RNA酶（经DEPC处理）的H₂ O。

2．RNA必须剪切成约150～200bp的合适长度。RNA剪切所需的最佳时间可以通过下式计算（Cox et al. 1984）：t＝（L₀ －L_f ）/（KL₀ L_f ）

此处L₀ 是RNA的初始长度（单位：kb），即转录起始位点到所选用的限制性内切酶的切割位点之间的距离；L_f 是RNA的最终长度（单位：kb）；K为0.11。时间的计算以分钟为单位。

2．在50μl RNA悬浮液中加入30μl 0.2mol/L Na₂ CO₃ 和20μl 0.2mol/L NaHCO₃ ，混匀。在60℃下温育t分钟。

3．加入3μl 3mol/L乙酸钠（pH6.0）和5μl 10％冰乙酸，终止反应。

4．加入3mol/L乙酸钠（pH6.0）至终浓度为0.3mol/L，再加入2倍体积冰冷的100％乙醇，沉淀RNA。－20℃保温1小时。

5．12 000g离心10分钟。用70％乙醇洗RNA沉淀。将RNA重新悬浮适量4×杂交储备液B中。通常用25μl杂交储备液B较合适。

杂交储备液B（4×）（10ml）：

DTT                             216mg

poly A                             20mg

tRNA                               6mg

6．取1μl样品，测定重新获得的RNA量。

7．走甲醛胶，测定剪切后RNA的大小。

 

（三）组织的预杂交处理

1．用100％的二甲苯洗载玻片2次，约10分钟，把Paraplast Plus^TM 从封固好的组织切片中洗去。然后将载玻片转移到100％乙醇中，反复浸泡、洗涤，直至载玻片上所有的条痕消失。

2．在室温下，依次用不同稀释度的乙醇水溶液（95％，75％，50％和25％）洗涤载玻片，使之重新水化。每一次都要将载玻片在乙醇溶液中反复浸泡，直至载玻片上所有的条痕消失。用水洗载玻片2次。将用过的乙醇/水溶液保存起来备用。

3．将载玻片在蛋白酶K溶液中37℃温育30分钟。用水洗载玻片2次。

4．为了减少RNA探针的非特异性结合，必须将组织中或玻璃片上残存的任何正电荷乙酰化。室温下，将载玻片置于约100ml 0.1mol/L三乙醇胺溶液（pH8.0）中平衡5分钟。倾去三乙醇胺溶液，立即加入约100ml新配制的0.25％乙酸酐溶液。室温下温育10分钟。

5．用2×SSC洗涤载玻片。将载玻片浸入溶液，再提出液面，如此反复15分钟。

6．在室温下，依次用不同稀释度的乙醇水溶液（25％，50％，75％和95％）洗涤载玻片，使组织切片脱水。然后用新的100％乙醇洗载玻片2次。每一次洗涤都应洗至载玻片上所有的条痕消失。

7．干燥组织切片。在真空下约1小时，在常温常压下要几个小时。

8．检查组织切片的完整性。给载玻片编号，用于组织类型、杂交探针的快速鉴定，等等。载玻片的磨砂端很容易用软芯铅笔作标记。标号的方式应便于杂交实验的进行。

 

（四）杂交

1．计算处理载玻片所需要的杂交缓冲液的量。将一定量的RNA探针加入适量的4×杂交贮液B，80℃温育5分钟，然后放至冰上快速冷却，得到变性的RNA探针。

杂交储备液B（4×）（10ml）：

DTT                             216mg

poly A                             20mg

tRNA                               6mg

2．取等量的4×杂交贮液A和含变性RNA探针的4×杂交贮液B混合均匀。

杂交贮液A（4×）（10ml）

5 mol/L NaCl                            2.4ml

1 mol/L Tris-HCl(pH7.5)                   0.4ml

0.5 mol/L EDTA(pH8.0)                    0.1ml

100×Denhardt’s溶液                        0.4ml

DTT                                     216mg

硫酸葡聚糖                                 4g

3．加入相当于4×杂交贮液A和B总体积的100％去离子的甲酰胺。再加入RNA酶抑制剂至终浓度为25单位/毫升。将杂交缓冲液置冰浴保存备用。

4．检查载玻片的编号是否正确，以免加杂交缓冲液时发生混淆。

5．37℃下加热杂交缓冲液2分钟。在每一个切片上加25μl温热的杂交缓冲液，再盖上经硅烷化的盖玻片。避免气泡产生！

6．将载玻片放入盘中，用湿纸巾或海绵覆盖，防止溶剂蒸发。42℃温育过夜。

 

（五）杂交后洗涤

1．在一个载玻片盘中加满含5 mmol/L DTT的4×SSC溶液。将与杂交缓冲液温育过夜的载玻片转移到一个载玻片固定器上，置于此载玻片盘中。几分钟后，盖玻片与载玻片之间的结合变得松散。提起载玻片时，盖玻片会轻轻地脱落下来。

2．盖玻片脱落下来后，将载玻片转移到含有含5 mmol/L DTT的4×SSC溶液中，室温下洗30分钟。用新鲜的溶液重复洗涤。

3．将载玻片放入含50μg/ml RNA酶A的RNA缓冲液中，37℃下温育3分钟。

4．37℃下，用约100ml含5mmol/L DTT的RNA酶缓冲液洗载玻片20分钟，除去RNA酶A。重复洗涤2次。

5．不严格洗涤。将载玻片置于500ml含5mmol/L DTT的2×SSC溶液中，室温下搅动30分钟。用新鲜溶液重复洗涤1次。

6．严格洗涤。将载玻片置于500ml含1mmol/L DTT的0.1×SSC溶液中，57℃下搅动30分钟。用新鲜溶液重复洗涤1次。

7．在室温下，依次用不同稀释度的乙醇水溶液（25％，50％，75％和95％）洗涤载玻片，使组织切片脱水。然后用100％乙醇洗载玻片2次。每一次洗涤都应洗至载玻片上所有条痕消失。

8．室温下，将组织切片真空干燥，约1小时。

 

（六）放射自显影

1．在完全黑暗或安全光照下，将放射自显影感光乳剂在45℃下熔化。此过程大约需要1～1.5小时。感光乳剂熔化后，用经过45℃预平衡的水按1：1的比例稀释。

2．将载玻片浸入感光乳剂中。为了避免出现条纹，浸入时动作要缓慢，并且一次性完成。把载玻片竖着放置在一个合适的架子上，室温下于黑暗中放置1小时，使之干燥。

3．将载玻片放入暗盒中，4℃下适度曝光。

4．曝光1～2天后，将载玻片显影。在15～20℃下，把载玻片浸入X光片显影液中，片刻后再提出液面，如此反复5次。使载玻片在显影液中的全部时间约为2.5分钟。过度显影可能会提高背景。

5．从显影液中取出载玻片，轻轻甩干（1～2秒即可）。

6．把载玻片浸入水中，再提出液面，如此大约30秒钟。

7．从水中取出载玻片，轻轻甩干。

8．在15～20℃下，把载玻片浸入X光片定影液中，片刻后再提出液面，如此反复5次。使载玻片在定影液中的全部时间约为5分钟。

9．从定影液中取出载玻片，轻轻甩干。

10．  将载玻片放入水中，用预冷的流水冲洗30分钟。然后立即染色。不要等载玻片干燥后再染色。

 

（七）染色

1．将载玻片放入0.05％的甲苯胺蓝溶液，室温下温育约2分钟。最好先取少量载玻片进行个别染色，以确定最佳的染色时间。因为不同类型的植物组织，染色的时间也不一样。

2．用水冲洗载玻片2次，约15秒钟，除去多余的染色液。

3．对染色后的组织切片进行快速脱水。在室温下，依次用不同稀释度的异丙醇水溶液（25％，50％，75％）洗涤载玻片。然后用100％异丙醇洗载玻片2次。

4．将载玻片在100％的二甲苯中反复浸蘸，直至所有条痕消失。

5．将载玻片在新鲜的100％二甲苯中浸蘸几次，然后浸泡在其中。进行下一步操作。

6．将4～5张Kimwipe叠放在一起。从二甲苯中取出一块载玻片置于其上。快速滴加Permount^TM 至载玻片表面。立即把盖玻片放到载玻片上。重复此操作，直至处理完全部载玻片。将载玻片过夜干燥。

7．在暗场显微镜观察载玻片，使用放大倍数5～20的物镜。

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