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原位杂交检测

上海歌凡生物科技有限公司

2145
原位杂交实验流程
  1. 常规脱蜡至水洗。
  2. 制作湿盒:用5×SSC35ml+甲酰胺(35ml)置于湿盒内。
  3. 30%H2O21+9份纯甲醇混合液室温处理10minDEPC水洗3次,每次1min;
  4. 切片置于湿盒内,用0.2mol/L盐酸滴于组织上,常温15min,用DEPC水洗2次,每次1min(盐酸可中和带电荷的碱性蛋白,降低背景)
  5. 蛋白酶K覆盖组织,分子杂交仪中3720min。蛋白酶K可以消化和暴露被遮蔽的靶核酸,增加探针的结合效率。
  6. 0.2%0.1mol/L甘氨酸洗液洗1min(现用现配),终止蛋白酶K
  7. PBS洗两次,每次一分钟。
  8. 4%PFA多聚甲醛固定组织10min
  9. PBS洗三次,每次1min
  10. acetic anhydride乙酸酐ph=8.0(乙酰化作用,降低背景)室温洗5min2.PBS5次,每次1min
  11. 5×SSCph7.5洗两次,每次1min
  12. 切片放置湿盒内,用预杂交液 覆盖组织,65预杂交 1h
  13. 500ng/ml FAM -labeled pube 探针覆盖切片,在杂交仪内65黑暗反应48h,。
  14. 2×SSC ph=7.5,室温洗1次,1min
  15. 用甲酰胺 4×SSC ph=4.5 1:1混合液在6065洗三次,每次20min
  16. PBS5次,每次1min,室温。
  17. DEPC处理水500倍稀释DAPI,染核5min
  18. 用PBS洗3遍,每遍5min.
  19. 滴加防淬灭剂,盖盖玻片。指甲油封片,荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察
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