原位杂交检测
上海歌凡生物科技有限公司
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原位杂交实验流程
- 常规脱蜡至水洗。
- 制作湿盒：用5×SSC（35ml）+甲酰胺（35ml）置于湿盒内。
- 30%H2O21份+9份纯甲醇混合液室温处理10min。DEPC水洗3次，每次1min;
- 切片置于湿盒内，用0.2mol/L盐酸滴于组织上，常温15min，用DEPC水洗2次，每次1min（盐酸可中和带电荷的碱性蛋白，降低背景）
- 蛋白酶K覆盖组织，分子杂交仪中37℃20min。蛋白酶K可以消化和暴露被遮蔽的靶核酸，增加探针的结合效率。
- 用0.2%或0.1mol/L甘氨酸洗液洗1min（现用现配），终止蛋白酶K。
- PBS洗两次，每次一分钟。
- 用4%PFA多聚甲醛固定组织10min。
- PBS洗三次，每次1min。
- 用acetic anhydride乙酸酐ph=8.0（乙酰化作用，降低背景）室温洗5min，2次.用PBS洗5次，每次1min。
- 用5×SSCph7.5洗两次，每次1min。
- 切片放置湿盒内，用预杂交液 覆盖组织，65℃预杂交 1h。
- 500ng/ml FAM -labeled pube 探针覆盖切片，在杂交仪内65℃黑暗反应48h，。
- 用2×SSC ph=7.5，室温洗1次，1min。
- 用甲酰胺 加4×SSC ph=4.5 1:1混合液在60℃或65℃洗三次，每次20min。
- 用PBS洗5次，每次1min，室温。
- 用DEPC处理水500倍稀释DAPI，染核5min。
- 用PBS洗３遍，每遍5min.
- 滴加防淬灭剂，盖盖玻片。指甲油封片，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察
