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用T4噬菌体多核苷酸激酶标记寡核苷酸探针

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合成的寡核苷酸在合成时其5'端缺少一个磷酸基, 因而极易用T4 噬菌体多核苷酸化反应,这种探针可达到于 γ 32 P从[ γ 32 P]ATP本身同样高的放射比活度。下面所述的反应是为对10pmol寡核苷酸进行高比活度的标记而设计的。通过扩大或缩小这一反应的规模便可成功地标记不同量的寡核苷酸,而各成分的浓度则可保持不变。
    1) 配制下列反应混合液:
寡核苷酸(10pmol/ μl) 1.0 μl
10xT
4 噬菌体多核苷酸酶缓冲液 2.0 μl
[
γ 32 P]ATP(比活度5000Ci/mmol;10mCi/ml水溶液)(10pmol) 5.0 μl水 11.4 μl
10xT4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液
0.5mol/L Tris.Cl(pH7.6)
0.1mol/L MgCl2
50mol/L 二硫苏糖醇(DTT)
1mol/L 盐酸亚清胺

1mol/L EDTA(pH8.0)充分混匀,在一装有10 μl 10mol/L Tris.Cl(pH8.0)的反应管内加入0.5 μl上述反应混合液,搁置一旁留备步骤3)中使用。该反应所含[ γ=32P]ATP和寡核苷酸的浓度相等,仅有50%的放射性标记物被转移至寡核苷酸。若将反应中寡苷酸浓度增至原来的10倍,可提高转移的效率,其结果导致近90%的放射性标记物转移至寡核苷酸。但是,寡核苷酸的放射性比活度却会降至原来的1/5。如果对一段寡酸进行高比活度标记,可以:
   a. 将反应中[ γ 32 P]ATP的浓度增加至原来的3倍(即反应混合液中使用15 μl放射性标记物而水的体积减小至1.4 μl。
   b. 将寡核苷酸浓度减小至3pmol。在这些情况下,仅有约10%的放射性标记物被转移,但实际上每个寡核苷酸分子都被标记。
        2) 在反应混合液中加入8单位(约1 μl)T4噬菌体多核苷酸激酶。 充分混匀,于37温育45分钟。人该反应液中另取0.5 μl 加至另一装有10 10mmol/LTris.Cl(pH8.0)的反应管中,搁置一旁留备步骤3)使用。于68将其余的反应液加热10分钟,以灭活T4噬菌体多核苷酸激酶。
        3) 按下列方法(Stawinski等,1977;Narang等,1980)确定32 P转移至寡核苷酸的效率并估算其比活度:
    a. 切下一张长约15cm、宽约5cm的浸过聚乙烯亚胺(Polygram CEL 300EI:Brinkmann)的纤维素纸条。用一支软铅铅笔在距一端2.5cm 处划一条横过纸条的细直线,在直线上作两个记号,两个记号间相距约1in(2.54cm)。
    b. 在两个记号处分别点上步骤1)、2)中搁置一旁的液体各0.5 μl,将纸条垂直置于一层析皿内,以使放射性样品处于纸条的下缘。纸条的底部应伸入一盛有高度的约为0.5cm的展开缓冲液(0.5mol/L碳酸氢铵)的平皿内。盖上层析掳。 使层析展开直至溶剂前沿迁移约4-5in(10.16-12.7cm)。
     c . 将聚乙烯亚胺-纤维素纸条包裹于Saran包装膜内,进行放射自显影,或将纸条水平切成窄(0.25cm)条,在液体闪烁计数仪中测量每一窄条的放射性活度。寡核苷酸仍留在起点处,而ATP和无机磷酸将与溶剂作同量方向移动,无机磷酸较溶剂前沿迁移得稍慢些,而ATP的位置几乎与起点和无机磷酸等距离。这样,如有磷酸从 γ 32 P]ATP转移至寡核苷酸,将导致原点样处出现放射性。 通过测量起点处和整张纸条的放射性活度值,便可计算出从 γ 32 P] ATP转移至寡核苷酸的放射性标记物所占百分比。再根据反应中胡核苷酸和 γ 32 P] ATP的摩尔数,便可计算出探针的比活度。在上述反应条件下,应有近50%的放射性活度转称至寡核苷酸,结果比活度接近2500Ci/mmol。转移至寡核苷酸的放射性标记亦可通过用DE-81滤膜吸收法来测定。寡核苷酸与带正电荷的滤膜牢固结合,而未掺入的放射性标记物则可用磷酸钠溶液反复洗涤而去除。
    4) 如果探针的比活度符合要求,则继续进行放射性标记的合成寡核苷栈的纯化。如果比活度太低,则另补加8单位酶, 继续于37 进一步温育30分钟(即共75分钟),并于68加热10分钟使酶失活,再次分析该反应的产物。

 

 

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