DNA（基因）检测－Southern Blot

DNA （基因）检测－ Southern Blot

 

DNA 吸印转移

1． 室温下将电泳后的琼脂糖凝胶浸入 500ml 溶液 A 中，摇动 30 分钟后换 500ml 新鲜溶液 A 再摇 30 分钟，使 DNA 双链碱变性。

溶液 A ：

5M NaCl     300.0ml

 

10M NaOH    50.0ml

 

H₂ O         650.0ml

 

2 ．为使凝胶重新回到中性，换入溶液 B 中重复上述 1 过程。

溶液 B ：

10M 乙酸铵       200.0ml

 

10M NaOH         4.0ml

 

H₂ O            1796.1ml

 

硝酸纤维素薄膜（ NC 膜）

 

3 ．料盒或盘中放一玻璃板支架，倒入 10 × SSC ，将 Whatman 3MM 滤纸放在玻璃板上，两头浸在液体中，用玻棒赶除气泡。

4． 心地将琼脂糖凝胶翻过（扣过来）滑到纸上，放平、赶除气泡。

5． 将预先浸于溶液 B 中的 NC 膜，平铺在胶上，用玻棒赶除气泡。

6． 在膜上放置两层预先以 10 × SSC 浸湿的 Whatman 3MM 滤纸。

7． 再放 6 张干燥吸水纸及 4 堆 3cm 厚的折叠吸水纸。

8． 在纸上覆盖玻璃平板，板上可置约 250g 重物，下部缓冲液根据虹吸原理能被吸上来，凝胶上的单链 DNA 即可被吸出并转移到 NC 膜上。转移速度取决于 DNA 片段的大小。 <1kb 的片段在 0.7 ％的胶中 2 小时即可转出，而 15kb 的片段需 15 小时以上，一般维持 12 ～ 24 小时。

9． 转移完成后，将胶与膜取出，通过样品槽、表明记号，并剪去膜的一角，以识别方向，此时膜与胶正面观察的方向是一致的。

10．  去掉胶，令膜稍加干燥，用圆珠笔标号。

11．  如为硝酸纤维素膜，则用 3MM 滤膜包好， 80 ℃烘烤 2 小时。若为尼龙膜则用紫外等照 10 分钟，使 DNA 牢固地结合于膜上，即可用于分子杂交。

12．  将膜在 6 × SSC 中浸泡几分钟，放入塑料袋，按 0.2ml/cm² 膜面积加入预杂交液，排净气泡封闭袋口，在 68 ℃水浴中振动预杂交 2 ～ 4 小时。

13．  取出塑料袋，在一角切一缺口，倒出预杂交液，按 50 μ l/cm² 膜面积加入杂交液，排净气泡、封口，再于 68 ℃水浴中振动杂交，一般来源于真核细胞的总 DNA ，需杂交 12 ～ 16 小时。

14．  杂交结束后取出塑料袋，剪开边缘，迅速将膜转到 2 × SSC 和 0.5 ％ EDTA 溶液中室温下洗涤（振荡） 5 分钟，再将膜转移人 2 × SSC 和 0.1 ％ SDS 溶液中洗涤 15min ，然后将膜浸入 0.1 倍 SSC 和 0.5 ％ SDS 溶液中 68 ℃振荡洗涤 2 小时，换同样溶液再洗涤 30 分钟。

15．  取出滤膜在 Whatman 滤纸上晾干，放入塑料袋或用塑料纸包好，在暗室中将 X 光片与滤膜接触，封于曝光夹中，进行放射自显影 1 ～ 15 天。

16．  X 光片被取出。常规显定影后显示杂交情况，如曝光时间不够可重新放入 X 光片再次曝光，直到带型显示清晰。