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蛋白质检测-Western Blot

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蛋白质检测- Western Blot

 

1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。

1) 转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜,将硝酸纤维素膜铺在凝胶上,用 5ml 移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。

2) 在凝胶 / 滤膜外再包一张 3mm 滤纸(预先用转移缓冲液浸湿),将凝胶夹在中间,保持湿润和没有气泡。

3) 将此滤纸 / 凝胶 / 薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中,凝胶面向阴极。

4) 将上述装置放入缓冲液槽中,并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。

5) 按照厂家所示接通电源开始电泳转移。

6) 转移结束后,取出薄膜和凝胶,弃去凝胶。

 

2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色,直至分子量标准显现时取出,记录下标准位置。

3. 100ml 水洗涤纤维素膜,必要时可用脱色缓冲液。

4. 膜置印迹缓冲液中于 37 ℃保温 1 小时。

5. 室温下,用 PBS-Tween 缓冲液洗涤薄膜。

6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中,尽可能不留空气。

7. 袋的一角剪一缓冲液的小口,用透析袋夹紧。

8. 混合: NGS(100 微升 ) ,印迹缓冲液中的抗体( 10 毫升),加在装薄膜的袋中,于室温下摇动 2 小时(或 4 ℃过夜)

9. 用总体积 300ml PBS-Tween 缓冲液,分 4 次在一浅盘中洗涤薄膜,每次 75ml

10.  将连接生物素的羊抗兔 IgG 40 微升溶于 10 毫升印迹缓冲液 /100 微升 NGS )加在袋内,于室温下摇动 1 小时。

11.  按步骤 9 洗涤。

12.  加入抗生素蛋白 -HRP 40 微升溶于 10 毫升印迹缓冲液 /100 微升 NGS ),于室温下摇动 1 小时。

13.  按步骤 9 洗涤。

14.  配制显色指示剂 / 底物:混合显色指示剂原液 3.0ml PBS 9.0ml ,加入 1% 过氧化氢 150.0 微升。立即使用。

15.  于室温下摇动直至出现紫色并开始看到背景( 1~10 分钟)。

16.  将薄膜转到另一盛水容器中洗涤,终止显色反应,空气干燥,封入塑料袋中避光保存。

 

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