蛋白质检测－Western Blot

蛋白质检测－ Western Blot

1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。

1） 转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用 5ml 移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。

2） 在凝胶 / 滤膜外再包一张 3mm 滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。

3） 将此滤纸 / 凝胶 / 薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。

4） 将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。

5） 按照厂家所示接通电源开始电泳转移。

6） 转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。

2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。

3. 用 100ml 水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。

4. 膜置印迹缓冲液中于 37 ℃保温 1 小时。

5. 室温下，用 PBS-Tween 缓冲液洗涤薄膜。

6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。

7． 袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。

8． 混合： NGS(100 微升 ) ，印迹缓冲液中的抗体（ 10 毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动 2 小时（或 4 ℃过夜）

9． 用总体积 300ml PBS-Tween 缓冲液，分 4 次在一浅盘中洗涤薄膜，每次 75ml 。

10． 将连接生物素的羊抗兔 IgG （ 40 微升溶于 10 毫升印迹缓冲液 /100 微升 NGS ）加在袋内，于室温下摇动 1 小时。

11． 按步骤 9 洗涤。

12． 加入抗生素蛋白 -HRP （ 40 微升溶于 10 毫升印迹缓冲液 /100 微升 NGS ），于室温下摇动 1 小时。

13． 按步骤 9 洗涤。

14． 配制显色指示剂 / 底物：混合显色指示剂原液 3.0ml ， PBS 9.0ml ，加入 1% 过氧化氢 150.0 微升。立即使用。

15． 于室温下摇动直至出现紫色并开始看到背景（ 1~10 分钟）。

16． 将薄膜转到另一盛水容器中洗涤，终止显色反应，空气干燥，封入塑料袋中避光保存。