NP40以及菌体/细胞裂解法

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采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质分析化学论坛~O/b:te}
  相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。
  不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
 
2、如何得到比较纯的包涵体
对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒DNA和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
1.2.5 DNA片段分析 SGC-7901感染Ad-p27mt和Ad-LacZ 48 h后离心去上清, 在剩余细胞沉淀中加500 mL的细胞裂解液(10 g/L Np40, 20 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)]和10 mL蛋白酶K. 在56℃水浴中加热1-2 h, 用苯酚和氯仿提取, 然后用脱水酒精沉淀DNA. 在700 mL/L酒精洗涤一次后加入200 mL TE. 然后再加入RNA酶(最终浓度为50 mL/L), 37℃下过夜. 然后在10
 
1.3   DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡   1×106细胞在含50μg/ml顺铂的培养液中培养12h，离心沉淀后，加入细胞裂解液（1% NP40，20mmol/L EDTA pH8.0，50mmol/L Tris-cl pH7.5），离心取上清加入10%SDS、蛋白酶K，50℃孵育2h，再加入RNase A室温放置1h。酚、氯仿抽提，取10μl DNA， 70℃放5min后，15ｇ/Ｌ琼脂糖凝胶，4V/cm电泳3h，观察结果并照像保存。
一、反复冻融法：
1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2、至少3次以上冻溶。

3、IFCC推荐法：
收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。

4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻

二、超声波处理法
1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。

2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。

3、100ml菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处理。750W 40％功率。5秒超声，9秒间隔。超声至少90min。

4、综合冻融和超声的方法：
1500g离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS重悬细胞。
将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞，并搅拌。
可选择：4℃下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT。4℃下111500g×60min离心裂解液。取出上清。过柱子。
Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Alternate Protocol

三、渗透法：
冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA处理，冰浴放置10min。
《精编分子生物学实验指南》

四、裂解液处理法：
1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。

2、在loading buffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。

3、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。