红霉素(Erythromycin)酶联免疫分析（ELISA）

红霉素(Erythromycin) 酶联免疫分析（ ELISA ）

试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用。

1 使用目的：

本试剂盒用于饲料、鱼、虾和肉类组织（如鸡、牛肉和猪肉），鸡蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿样中红霉素 (Erythromycin) 残留的定量检测。

2 实验原理

本试剂盒采用竞争 ELISA 方法，在微孔板包被有 红霉素 (Erythromycin) 偶联抗原，加入 红霉素 (Erythromycin) 标准品或样品，游离 红霉素 (Erythromycin) 与微孔条上预包被的 红霉素 (Erythromycin) 偶联抗原互相竞争抗 红霉素 (Erythromycin) 抗体酶标记物，用 TMB 底物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在 450nm 波长下进行检测，吸光值与样品中 红霉素 (Erythromycin) 含量成反比，通过标准曲线计算样品中 红霉素 (Erythromycin) 的含量。  

3 试剂盒组成

3.1 预包被的 红霉素 (Erythromycin) 偶联抗原的可拆酶标板： 1 块（ 12 孔 ×8 条）。
3.2 红霉素 (Erythromycin) 标准品： 6 瓶（ 1ml/ 瓶），含量分别是： 0 ppb, 5 ppb,15 ppb,45 ppb,135 ppb,405ppb

3.3 抗 磺胺嘧啶 (SD) 抗体酶结合物： 1 瓶（ 6ml ）。
3.4 显色液 A ： 1 瓶（ 6ml ）。
3.5 显色液 B ： 1 瓶（ 6ml ）。
3.6 终止液： 1 瓶（ 6ml ）， 2M 硫酸。
3.7 样本稀释液： 1 瓶（ 10×,  6ml ），用于样品稀释用。
3.8 浓缩洗涤液： 1 瓶（ 20× ， 20ml ），用于洗板。
3.9 说明书一份。

4 需要而未提供的材料
4.1 设备
4.1.1 波长 450nm 酶标仪。
4.1.2 粉碎机。
4.1.3 量筒。
4.1.4 振荡器。
4.1.5 漏斗。
4.1.6Whatman No 1 或相当的滤纸。
4.1.7 微量移液器。
4.2 试剂
4.2.1 去离子水或蒸馏水。
4.2.2 甲醇。
5 贮存
5.1 试剂盒贮存于 2~8 ℃，切勿冷冻
5.2 未用完的微孔板应该密封干燥保存
6 注意事项
6.1 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。
6.2 不要使用过期试剂盒。
6.3 试剂盒使用前，将试剂恢复至室温（ 25±2 ℃），建议至少回温 2 小时。
6.4 标准品中含有红霉素 (Erythromycin) ，使用时应特别注意，操作时应带手套。
6.5 终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。
6.6 不同标准品、样品所用吸头不能混用，否则会影响试验结果。
6.7 不同批号试剂盒中的试剂不得混用；不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响实验结果。
6.8 稀释样本时必须用本试剂盒中的样本稀释液，否则会影响实验结果
6.9 混合试剂时应避免起泡。
7 工作液准备
7.1 红霉素 (Erythromycin) 标准品溶液： 0 ppb, 5 ppb,15 ppb,45 ppb,135 ppb,405ppb

7.2 浓缩洗涤液：用蒸馏水按 1:20(1+19) 稀释备用

7.3 样本稀释液：备用
7.3 显色剂：已备用，避免光线直照
7.4 反应终止液：已备用
8 样品处理程序 （样品在提取过程中，要严格按说明书操作，提取过程中应准确稀释，否则会出现结果不准确，样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存）
8.1 取 10g 粉碎的样品，加 20ml 70% 甲醇溶液
8.2 强力振荡 3 分钟
8.3 用 Whatman No 1 滤纸过滤
8.4 取 100µl 处理后的样品，加入 400µl 样本稀释液
8.5 取 50μl 稀释液进行分析（稀释倍数 10 ）

9 酶免分析步骤
9.1 实验须知
9.1.1 实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢复至室温（ 25±2 ℃），时间约 2 小时。回温至室温（ 25±2 ℃）后再取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于 2~8 ℃干燥保存
注：一定保证回温充分，否则影响检测的精确度和准确度。
9.1.2 使用后请立即将试剂放回 2~8 ℃保存
9.1.3 请不要改变分析程序
9.1.4 请使用精确的微量移液器
9.1.5 操作一旦开始，请不要中断任何程序
9.1.6 ELISA 结果的可重复性极大程度的取决于操作程序，请严格按照要求操作
9.1.7 为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样
9.1.8 加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面
9.2 分析步骤
9.2.1 预先进行编号，标记 B0 、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测
9.2.2 取所需数量的微孔（微孔条可拆），将多余板条重新密封并立即放回 2~8 ℃保存
9.2.3 样品稀释液（ 10× ）、浓缩洗涤液（ 10× ）稀释成工作液 ( 蒸馏水或去离子水稀释 )
9.2.4 在 B0 孔中加入 50µl0.0 ppb 标准品溶液
9.2.5 在各标准孔中加入 50μl 的标准品溶液
9.2.6 在各样品孔中加入 50µl 样品溶液
9.2.7 在所有孔中加入 50µl 的抗红霉素 (Erythromycin) 抗体酶结合物
9.2.8 轻轻晃动反应板几秒钟。
9.3 37 ℃温浴 30min （温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差）
9.3.1 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板 5 次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。
9.4 反应
9.4.1 洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入 50µl 显色液 A ，再加 50µl 显色液 B ；轻微晃动反应板使之彻底混匀
9.4.2 37 ℃温浴 10min
9.4.3 每孔中加入 50µl 终止液，混匀
9.4.4 在 450nm 下检测吸光度，结果在 5min 内读取。
10 结果计算
10.1 定量分析
10.1.1 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（ B ）除以第一个标准（ 0 标准）的吸光度值（ B0 ）再乘以 100% ，即百分吸光度值。
B― 标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0―0 ppb 标准溶液的平均吸光度值
10.1.2 以红霉素 (Erythromycin) 浓度的对数值为 X 轴，百分吸光度值为 Y 轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为红霉素 (Erythromycin) 浓度的对数值，求得反对数即为测定液中红霉素 (Erythromycin) 浓度 C （ ppb ）
10.1.3 由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数。
10.2 半定量测定
10.1.1 目测半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品吸光度值的高低比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。
10.1.2 仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品颜色深浅比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。

11 特异性
物质 交叉反应
红霉素 (Erythromycin) 100%

12 试剂盒参数
本试剂盒检测下限为 5ppb
B0 吸光度最佳值应大于 1.0
试剂盒吸光度板内误差小于 8 ％，板间误差小于 15 ％。
用本说明书提供的组织样本提取方法回收率大于 80 ％。
13 标准曲线模式（仅供参考）
试剂盒提供的标准曲线范围为 5ppb~405ppb 。

14 分析限制
本试剂盒检测为阳性的样品应该用另一种方法如 HPLC 或 GC/MS 加以确证。