实验室常用技术参数资料(二)
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二、常用缓冲液
1.分子克隆常用缓冲液
2.磷酸缓冲液
(1)25℃下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制※
pH |
1mol/L K2 HPO4 (ml) |
1mol/L KH2 PO4 (ml) |
5.8 |
8.5 |
91.5 |
6.0 |
13.2 |
86.8 |
6.2 |
19.2 |
80.8 |
6.4 |
27.8 |
72.2 |
6.6 |
38.1 |
61.9 |
6.8 |
49.7 |
50.3 |
7.0 |
61.5 |
38.5 |
7.2 |
71.7 |
28.3 |
7.4 |
80.2 |
19.8 |
7.6 |
86.6 |
13.4 |
7.8 |
90.8 |
9.2 |
8.0 |
94.0 |
6.2 |
(2)25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制※
pH |
1mol/L Na2 HPO4 (ml) |
1mol/L NaH2 PO4 (ml) |
5.8 |
7.9 |
92.1 |
6.0 |
12.0 |
88.0 |
6.2 |
17.8 |
82.2 |
6.4 |
25.5 |
74.5 |
6.6 |
35.2 |
64.8 |
6.8 |
46.3 |
53.7 |
7.0 |
57.7 |
42.3 |
7.2 |
68.4 |
31.6 |
7.4 |
77.4 |
22.6 |
7.6 |
84.5 |
15.5 |
7.8 |
89.6 |
10.4 |
8.0 |
93.2 |
6.8 |
※:用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000ml,根据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH值:
pH=pK’+1g([质子受体]/[质子供体])
在此,pK’=6.86(25℃)。
3.电泳缓冲液
测序凝胶加样缓冲液
98%去离子甲酰胺
10mol/L EDTA(pH8.0)
0.025%二甲苯青FF
0.025%溴酚蓝
甲酰胺:许多批号的试剂级甲酰胺,其纯度符合使用要求,无须再进行处理。不过,一旦略呈黄色,则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8 混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理,并用Whatman 1号滤纸过滤2次,去离子甲酰胺分装成小份,充氮存于-70℃。
常用的电泳缓冲液
缓冲液 |
使用液 |
浓贮存液(每升) |
Tris-乙酸(TAE) | 1×:0.04mol/L Tris-乙酸 | 50×:242g Tris碱 |
0.001mol/L EDTA | 57.1ml冰乙酸 | |
100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) | ||
Tris-磷酸(TPE) | 1×:0.09mol/L Tris-磷酸 | 10×:10g Tris碱 |
0.002mol/L EDTA | 15.5ml85%磷酸(1.679g/ml) | |
40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) | ||
Tris-硼酸(TBE)a | 0.5×0.045mol/L Tris-硼酸 | 5×:54g Tris碱 |
0.001mol/L EDTA | 27.5硼酸 | |
20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) | ||
碱性缓冲液b | 1×:50mmol/L NaOH | 1×:5ml 10mol/L NaOH |
1mmol/L EDTA | 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0) | |
Tris-甘氨酸c | 1×:25mmol/L Tris | 5×:15.1g Tris |
250mmol/L 甘氨酸 | 94g 苷氨酸(电泳级)(pH8.3) | |
0.1% SDS | 50ml 10% SDS(电泳级) |
说明:
①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物,为避免这一问题,可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液,出现沉淀后则予以废弃。
以片都以1×TBE作为使用液(即1:5稀释浓贮液)进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1:10稀释的贮存液作为使用液。
进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小, 故通过缓冲液的电流量通常较大,需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。
②碱性电泳缓冲液应现用现配。
③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2×SDS凝胶加样缓冲液:
100mmol/L Tris・HCl(6.8)
200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)
4%SDS(电泳级)
0.2%溴酚蓝
20%甘油
不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温,应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。
4.凝胶加样缓冲液
缓冲液类型 |
6×缓冲液 |
贮存温度 |
|
0.25%溴酚蓝 |
|
0.25%二甲苯青FF | ||
40%(W/V)蔗糖水溶液 | ||
|
0.25溴酚蓝 |
|
0.25%二甲苯青FF | ||
15%聚蔗糖(Ficoll400) | ||
|
0.25%溴酚蓝 |
|
0.25%二甲苯青FF | ||
30%甘油水溶液 | ||
|
0.25%溴酚蓝 |
|
40%(W/V)蔗糖水溶液 | ||
碱性加样缓冲液: | ||
300mmol/L NaOH | ||
6mmol/L EDTA | ||
|
18%聚蔗糖(Ficoll400) |
|
0.15%溴甲酚绿 | ||
0.25%二甲苯青FF |
使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三:增大样品密度;以确保DNA均匀进入样品孔内;使样品呈现颜色,从而使加样操作更为便利,含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍,而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时,溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同,而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%~1.4%的范围内,这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。
选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是,对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料,因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。
5.各种pH值的Tris缓冲液的配制
各种pH值的Tris缓冲液的配制 |
|
所需pH值(25℃) |
0.1mol/L HCl的体积 |
7.1 |
45.7 |
7.2 |
44.7 |
7.3 |
43.4 |
7.4 |
42.0 |
7.5 |
40.3 |
7.6 |
38.5 |
7.7 |
36.6 |
7.8 |
34.5 |
7.9 |
32.0 |
8.0 |
29.2 |
8.1 |
26.2 |
8.2 | 22.9 |
8.3 | 19.9 |
8.4 | 17.2 |
8.5 | 14.7 |
8.6 | 12.4 |
8.7 | 10.3 |
8.8 | 8.5 |
8.9 |
7.0 |
某一特定pH值的0.05mol/L Tris缓冲液的配制:将50ml 0.1mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积(单位:ml)的0.1ml/L HCl混合,加水将体积调至100ml
(2)温度对50mmol/L Tris・HCl液pH值的影响
4℃ |
25℃ |
37℃ |
8.1 |
7.5 |
7.2 |
8.2 |
7.6 |
7.3 |
8.3 |
7.7 |
7.4 |
8.4 |
7.8 |
7.5 |
8.5 |
7.9 |
7.6 |
8.6 |
8.0 |
7.7 |
8.7 |
8.1 |
7.8 |
8.8 |
8.2 |
7.9 |
8.9 |
8.3 |
8.0 |
9.0 |
8.4 |
8.1 |
9.1 |
8.5 |
8.2 |
9.2 |
8.6 |
8.3 |
9.3 |
8.7 |
8.4 |
9.4 |
8.8 |
8.5 |
(6)常用缓冲液的pKa值
缓冲液 |
分子量 |
pKa值 |
缓冲范围 |
Trisa |
12.1 |
8.08 |
7.1~7.9 |
HEPESb |
283.3 |
7.47 |
7.2~8.2 |
MPOSc |
209.3 |
7.15 |
6.6~7.8 |
PIPESd |
304.3 |
6.76 |
6.2~7.3 |
MESe |
195.2 |
6.09 |
5.4~6.8 |
a:三羟甲基氨基甲烷;b:N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸;c:3-(N-吗啉代)丙磺酸;d:N,N’-双(2-乙磺酸)哌嗪;e:2-(N-吗啉代)乙磺酸。
7.温度对常用缓冲液pH的影响
缓冲体系 |
pKa(20℃) |
△pKa/10℃ |
Mes |
6.15 |
-0.110 |
Ada |
6.60 |
-0.110 |
PiPes |
6.80 |
-0.085 |
Aces |
6.90 |
-0.200 |
Bes |
7.15 |
-0.160 |
Mops |
7.20 |
-0.013 |
Tes |
7.50 |
-0.200 |
Hepes |
7.55 |
-0.014 |
Tricine |
8.15 |
-0.210 |
Tris |
8.30 |
-0.310 |
Bicine |
8.35 |
-0.180 |
Glycylglycine |
8.40 |
-0.280 |
三、常用酶的配制
1.溶菌酶
用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液,分装成小份并保存于-20℃。每一小份一经使用后便予丢弃。
2.蛋白水解酶类
贮存液 | 贮存温度 | 反应浓度 | 反应缓冲液 | 温度 | 预处理 | |
0.01mol/L Tris(pH7.8) | ||||||
链霉蛋白酶a | 20mg/ml | -20℃(溶于水) | 1mg/ml | 0.01mol/L EDTA | 37℃ | 自消化b |
0.5% SDS | ||||||
0.01mol/L Tris(pH7.8) | ||||||
蛋白酶Kc | 20mg/ml | -20℃(溶于水) | 50μg/ml | 0.005mol/L EDTA | 37~56℃ | 无须预处理 |
0.5% SDS |
a:链霉蛋白酶是从链球菌(Streptomyces griseus)中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。
b:自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染,经自消化的链酶蛋白酶的配制方法如下:把该酶的粉末溶解于10mmol./l Tris・HCl(pH7.5)、10mmol/l NaCl中,配成20mg/ml浓度,于37℃温育1h。经消化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中,保存-20℃。
c:蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶,从林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)中纯化得到。该酶有两个Ca2+ 结合位点,它们离酶的活性中心有一定距离,与催化机理并无直接关系。然而,如果从该酶中除去Ca2+ ,由于出现远程的结构变化,催化活性将丧失80%左右,但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以,蛋白酶K消化过程中通常加入EDTA(以抑制依赖于Mg2+ 的核酸酶的作用)。但是,如果要消化对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白,如角蛋白一类,则可能需要使用含有1mmol/l Ca2+ 而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGT(pH8.0)至终浓度为2mmol/L,以鳌合Ca2+ 。
3.无DNA酶的RNA酶
将胰RNA酶(RNA酶A)溶于10mmol/l Tris・HCl(pH7.5)、15mmol/l NaCl中,配成10mg/ml的浓度,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-20℃。
四、常用抗生素溶液
|
贮存液a |
工作浓度 |
||
浓度 |
保存条件 |
严紧型质粒 |
松弛型质粒 |
|
氨苄青霉素 | 50mg/ml(溶于水) |
-20℃ |
20μg/ml |
60μg/ml |
羧苄青霉素 | 50mg/ml(溶于水) |
-20℃ |
20μg/ml |
60μg/ml |
氯霉素 | 34mg/ml(溶于乙醇) |
-20℃ |
25μg/ml |
170μg/ml |
卡那霉素 | 10mg/ml(溶于水) |
-20℃ |
10μg/ml |
50μg/ml |
链霉素 | 10mg/ml(溶于水) |
-20℃ |
10μg/ml |
50μg/ml |
四环素b | 5mg/ml(溶于乙醇) |
-20℃ |
10μg/ml |
50μg/ml |
a:以水为溶剂的抗生素贮存液通过0.22μm滤器过滤除菌。以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。
b:镁离子是四环素的拮抗剂,四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基(如LB培养基)。
五、常用贮存液的配制
1.30%丙烯酰胺溶液
【配制方法】
将29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之,补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器(0.45μm孔径)过滤除菌,查证该溶液的pH值应不大于7.0,置棕色瓶中保存于室温。
【注意】
丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收,其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能会含有少量未聚合材料。
一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子,在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床混合树脂(MB-1Mallinckrodt),搅拌过夜,然后用Whatman 1号滤纸过滤以纯化之。
在贮存期间,丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。
2.40%丙烯酰胺
【配制方法】
把380g丙烯酰胺(DNA测序级)和20g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理,但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。
【注意】
见上述配制30%丙烯酰胺的说明,40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。
3.放线菌素D溶液
【配制方法】
把20mg放线菌素D溶解于4ml 100%乙醇中,1:10稀释贮存液,用100%乙醇作空白对照读取OD440 值。放线菌素D(分子量为1255)纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21,900,故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为0.182,放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中,保存于-20℃。
【注意】
放线菌素D是致畸剂和致癌剂,配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作,而不能在开放在实验桌面上进行,谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。
药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度,这类制品便可用于抑制自身引导作用。
4.0.1mol/L腺苷三磷酸(ATP)溶液
【配制方法】
在0.8ml水中溶解60mg ATP,用0.1mol/L NaOH调至pH值至7.0,用蒸馏水定容1ml,分装成小份保存于-70℃
5.10mol/L乙酸酰溶液
【配制方法】
把770g乙酸酰溶解于800ml水中,加水定容至1L后过滤除菌。
6.10%过硫酸铵溶液
【配制方法】
把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中,该溶液可在4℃保存数周。
7.BCIP溶液
【配制方法】
把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐(BCIP)溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中,保存于4℃
8.2×BES缓冲盐溶液
【配制方法】
用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BES[N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸]、1.6g NaCl和0.027g Na2 HPO4 ,室温下用HCl调节 该溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成小份,保存于-20℃。
9.1mol/L CaCl2 溶液
【配制方法】
在200ml蒸馏水中溶解54g CaCl2 ・6H2 O,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成10ml小份贮存于-20℃。
【注意】
制备感受态细胞时,取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml,用Nalgene滤器(0.45μm孔径)过滤除菌,然后骤冷至0℃。
10.2.5mol/L CaCl2 溶液
【配制方法】
在20ml蒸馏水中溶解13.5g CaCl2 ・6H2 O,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成1ml小份贮存于-20℃。
11.1mol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液
【配制方法】
用20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)溶解3.09g DTT,过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。
【注意】
DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。
12.脱氧核苷三磷酸(dNTP)溶液
【配制方法】
把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右,用微量移液器吸取0.05mol/l Tris碱分别调节 每一dNTP溶液的pH值7.0(用pH试纸检测),把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释,在下表中给出的波长下读取光密度计算出每种dNTP的实际浓度,然后用水稀释成终浓度为50mmol/L的dNTP,分装成小份贮存于-70℃。
碱基 |
波长(nm) |
消化系数(ε)[L/(mol・cm)] |
A |
259 |
1.54×104 |
G |
253 |
1.37×104 |
C |
271 |
9.10×103 |
T |
260 |
7.40×103 |
比色杯光径为1cm时,吸光度=εM
13.0.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液
【配制方法】
在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na・2H2 O),在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用NaOH调节 溶液的pH值至8.0(约需20g NaOH颗粒)然后定容至1L,分装后高压灭菌备用。
【注意】
EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0,才能完全溶解。
14.溴化乙锭(10mg/ml溶液)
【配制方法】
在100ml水中加入1g溴化乙锭,磁力搅拌数小时以确保其完全溶解,然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中,保存于室温。
【注意】
小心:溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性,使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套,称量染料时要戴面罩。
15.2×HEPES缓冲盐溶液
【配制方法】
用总量为90ml的蒸馏水溶解1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2 PO4 ・2H2 O、0.2g葡聚糖和1gHEPES,用0.5mol/l NaOH调节 pH值至7.05,再用蒸馏水定容至100ml。用0.22μm滤器过滤除菌,分装成5ml小份,贮存于-20℃。
16.IPTG溶液
【配制方法】
IPTG为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(分子量为238.3),在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后,用蒸馏水定容至10ml,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成1ml小份贮存于-20℃。
17.1mol/L乙酸镁溶液
【配制方法】
在800ml水中溶解214.46g四水乙酸镁,用水定容至1L过滤除菌。
18.1mol/L MgCl2 溶液
【配制方法】
在800ml水中溶解203.4g MgCl2 ・6H2 O,用水定容至1L,分装成小份并高压灭菌备用。
【注意】
MgCl2 极易潮解,应选购小瓶(如100g)试剂,启用新瓶后勿长期存放。
19.β-巯基乙醇(BME)溶液
【配制方法】
一般得到的是14.4mol/L溶液,应装在棕色瓶中保存于4℃。
【注意】
BME或含有BME的溶液不能高压处理。
20.NBT溶液
【配制方法】
把0.5g氯化氮蓝四唑溶解于10ml 70%的二甲基甲酰胺中,保存于4℃。
21.酚/氯仿溶液
【配制方法】
把酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/L Tris・HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物,置棕色玻璃瓶中,上面覆盖等体积的0.01mol/l Tris・HCl(pH7.6)液层,保存于4℃。
【注意】
酚腐蚀性很强,并可引起严重灼伤,操作时应戴手套及防护镜,穿防护服。所有操作均应在化学通风橱中进行。与酚接触过的部位皮肤应用大量的水清洗,并用肥皂和水洗涤,忌用乙醇。
22.10mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液
【配制方法】
用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml(10mmol/L),分装成小份贮存于-20℃。如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液(100mmol/L)。
【注意】
PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤,吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF,应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。
PMSF在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快,且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时,20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min,这表明将PMSF溶液调节 为碱性(pH>8.6)并在室温放置数小时后,可安全地予以丢弃。
23.磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液
【配制方法】
在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2 HPO4 和0.24g KH2 PO4 ,用HCl调节 溶液的pH值至7.4加水定容至1L,在15lbf/in2 (1034×105 Pa)高压下蒸气灭菌20min。保存于室温。
24.1mol/L乙酸钾(pH7.5)溶液
【配制方法】
将9.82g乙酸钾溶解于90ml纯水中,用2mol/L乙酸调节 pH值至7.5后加入纯水定容到1L,保存于-20℃。
25.乙酸钾溶液(用于碱裂解)
【配制方法】
在60ml 5mol/L乙酸钾溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml水,即成钾浓度为3mol/L而乙酸根浓度为5mol/L的溶液。
26.3mol/L乙酸钠(pH5.2和pH7.0)溶液
【配制方法】
在80ml水中溶解408.1g三水乙酸钠,用冰乙酸调节 pH值至5.2或用稀乙酸调节 pH值至7.0,加水定容到1L,分装后高压灭菌。
27.5mol/L NaCl溶液
【配制方法】
在800ml水中溶解292.2g NaCl加水定容至1L,分装后高压灭菌。
28.10%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液
【配制方法】
在900ml水中溶解100g电泳级SDS,加热至68℃助溶,加入几滴浓盐酸调节 溶液的pH值至7.2,加水定容至1L,分装备用。
【注意】
SDS的微细晶粒易扩散,因此称量时要戴面罩,称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS,10%SDS溶液无须灭菌。
29.20×SSC溶液
【配制方法】
在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠,加入数滴10mol/l NaOH溶液调节 pH值至7.0,加水定容至1L,分装后高压灭菌。
30.20×SSPE溶液
【配制方法】
在800ml水中溶解17.5g NaCl、27.6g NaH2 PO4 ・H2 O和7.4g EDTA,用NaOH溶液调节 pH值至7.4(约需6.5ml 10ml/L NaOH),加水定容至1L,分装后高压灭菌。
31.100%三氯乙酸溶液
【配制方法】
在装有500g TCA的瓶中加入227ml水,形成的溶液含有100%(M/V)TCA。
32.1mol/L Tris溶液
【配制方法】
在800ml水中溶解121.91g Tris碱,加入浓HCl调节 pH值至所需值。
pH HCl
7.4 70ml
7.6 60ml
8.0 42ml
应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值,加水定容至1L,分装后高压灭菌。
【注意】
如1mol/L溶液呈现黄色,应予丢弃并置备质量更好的Tris。
尽管多种类型的电极均不能准确测量Tris溶液的pH值,但仍可向大多数厂商购得合适的电极。
Tris溶液的pH值因温度而异,温度每升高1℃,pH值大约降低0.03个单位。例如:0.05mol/L的溶液在5℃、25℃、和37℃时的pH值分别为9.5、8.9和8.6。
33.Tris缓冲盐溶液(TBS)(25mmol/l Tris)
【配制方法】
在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl和3g Tris碱,加入0.015g酚并用HCl调至pH值至7.4,用蒸馏水定容至1L,分装后在151bf/in2(1.034×105 Pa)高压下蒸汽灭菌20min,于室温保存。
34.X-gal溶液
【配制方法】
X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中,装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏,并应贮存于-20℃。X-gal溶液无须过滤除菌。
杂交试验中用于降低背景的封闭剂
试剂 |
用途 |
Denhardt试剂 | Northern杂交 |
使用RNA探针的杂交 | |
单拷贝序列的Southern杂交 | |
将DNA固定于尼龙膜上的杂交 | |
Denhardt试剂通常配制50×贮存液,过滤后保存于-20℃。可将该贮存液10倍稀释于预杂交液(常为含有0.5%SDS和100μg/ml经变性被打断的鲑精DNA的6×SSC或6×SSPE)中。50×Denhardt液中含5g聚蔗糖(Ficoll,400型,Pharmacia)、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白(组分V”Sigmal),加水至终体积为500ml。 | |
BLOTTO | Grunstein-Hogness杂交 |
Benton-Davis杂交 | |
除单拷贝序列Southern杂交以外的所有Southern杂交 | |
斑点印迹 | |
1×BLOTT(牛乳转移技术优化液,Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer),是含5%胶脂奶粉和0.02%叠氮钠的水溶液,应保存于4℃。使用前可用预杂交液稀释25倍。BLOTTO不应与高浓度的SDS并用,因为后者会导致牛奶中蛋白质析出。如果杂交背景不合要求,可在杂交液中加入NP-40至终浓度为1%。BLOTTO不能用作Northern杂交的封闭剂,因为这一封闭剂中可能含有RNA酶,其活性之高使人无法接受。 | |
注意:叠氮钠有毒性,取用时需戴手套小心操作。含叠氮钠的溶液应予明确标记。 | |
肝素 | Southern杂交 |
原位杂交 | |
肝素(Sigma H-7005,从猪中提取的二级产品或相当等级的产品)用4×SSPE或4×SSC溶解配制成50mg/ml的浓度,保存于4℃。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的杂交液中用作封闭剂的浓度为500μg/ml,在不含葡聚糖硫酸酯的杂交液中的浓度为50μg/ml。 | |
经变性并被打断的鲑精DNA | southern和Northern杂交 |
把鲑鱼精子DNA(Sigma,Ⅲ,盐钠)溶解于水配制成10mg/ml的浓度,必要时于室温磁力搅拌2~4h助溶。把溶液中NaCl的浓度调至0.1mol/L,并用酚和酚/氯仿各抽提一次,回收水相。合DNA溶液快速通17号皮下注射针头12次,以剪切DNA。加入2倍体积用冰预冷的乙醇沉淀DNA。离心回收DNA并重溶于水,配制成10mg/ml的浓度,测定溶液的OD260 值并计算出精确的DNA浓度,然后煮沸10min,分装成小份保存于-20℃。使用前置沸水浴中加热5min,然后迅速在冰浴中骤冷。预杂交液中应含有100μg/ml经变性并被打断的鲑鱼精子DNA |