如何利用Primer5.0 设计简并引物

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一步步教你设计简并引物

简并引物设计 都要注意些什么呢？用Primer5.0怎样设计兼并引物呢？下面是网上找到的详细的简并引物设计原则和Primer5.0 设计简并引物的方法可以参考下：

理论上说：由氨基酸回导核酸序列，同时考虑到细菌使用密码子的偏爱性，以减少兼并度，但是这样得到的兼并引物的兼并密码子比较多，我建议你可以先从网上找到已经报道的比较近的几种菌的序列，然后比对，设计兼并引物，这样做没问题，我觉得还比较简便，因为我就是这么做的，也没用primer软件 啊!

另外3端最好不是简并密码子，你可以在网上查查看。

下面是网上找到的详细的简并引物设计 原则和Primer5.0 设计简并引物的方法可以参考下：

简并引物设计 原则：

1. 选择高度保守的序列作为引物。如果可能的话，选择在基因家族内和不同种属间都保守的序列。

2. 选择兼并度最小的序列

a. 含有色氨酸和甲硫氨酸的肽段为首选，因为其密码子是唯一的

b. 尽可能不用含有亮氨酸、精氨酸、丝氨酸的肽段。

3. 若引物序列高度简并，利用脊椎动物基因组 中CpG二核苷酸的较低丰度，可望降低兼并度。并结合密码子优先表，或在有兼并度的地方引入次黄苷来降低兼并度。

4. 引物的3‘端残基尽可能使用确定残基。但令人吃惊的是，当G、C或T发生错配时，3’端的T残基相对保持中立。

5. PCR产物的合适长度为200～1000bp。

6. 如果蛋白中有两个以上的区域高度保守，可构建几套PCR引物，以便使用“巢式”PCR来增加特异性。

PCR反应条件

1. 退火温度 总的来说，退火温度越低，非特异性扩增的可能性越大。低至37度的退火温度也可被采用于高度简并的引物进行PCR扩增。Touchdown PCR也可以减少错误扩增

2. 扩增的循环数 过多循环数导致非特异性带的产生;可以每5个循环取一定样品来检测扩增的特异性

3. 降温时间 不同的PCR仪效率不同。较长的降温时间有利于错配杂交的产生

4. PCR缓冲液成分 主要在于Mg++离子的浓度。

Primer5.0 设计简并引物的方法：

首先把各个CDs序列分别存储为fasta格式，然后在 file-open-DNA sequence 里边把各个序列依次加入，然后点击align，比对完之后再点击primer，调整参数进行search或手工拉动选择引物。表现的形式是非简并性的，但是你从下边可以看得出来哪个碱基是非简并性的，再手工调整。其他原则同一般的简并引物设计原则，如3‘避免简并性等等。

还可以在线用codehop设计，如果需要这种方法，我可以告诉你怎么搞。