焦磷酸测序(Pyrosequencing)原理

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焦磷酸测序 技术(pyrosequencing)是一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性(single nucle—otide potymorphisms，SNPs)研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。该技术进行改进后可以满足上百个核苷酸序列的测序工作， 这样该技术又可以满足对重要微生物的鉴定与分型，特定DNA片段的突变检测和克隆鉴定等方面的应用。

1.焦磷酸测序 技术原理

焦磷酸测序 技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine- 5’-phosphosulfat，APS)、荧光素(1uciferin)。

2.焦磷酸测序 技术的反应过程

在每一轮测序反应中，反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP,在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过微弱光检测装置及处理软件 可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一个碱基配对，则上述反应不会发生，也就没有检测峰。反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。待上一轮反应完成后，加入另一种dNTP，使上述反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。

3.焦磷酸测序技术基因分析上的应用

焦磷酸测序技术可以用来研究单核苷酸多态性(single ucleotide polymor—phism，SNP)，遗传多态性，植物多态性分析，分子诊断细菌与病毒分型、甲基化分析、法医鉴定及药物基因组学等方面都有广泛的应用。该技术不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，具有大通量、低成本、快速、直观的特点。与Sanger测序法相比，焦磷酸测序技术有其特定的优势，已经成为DNA分析研究的重要手段。目前已经有很多关于该技术在分子生物学上的应用研究，而且随着技术的不断成熟和改进，在实践中的应用将越来越广泛。Jonasson等运用焦磷酸测序技术通过检测病原菌16S rRNA基因，快速鉴定临床标本中抗生素抵抗菌;Monstein等用焦磷酸测序技术检测幽门螺杆菌16S rRNA基因(16S rDNA)易变的Vl和V3区序列，证明该技术可满足对临床病原菌标本的快速鉴定和分型;Unnerstad等利用该技术对106株不同血清型的单核细胞增生李斯特氏菌进行了分型，在短时间内完成大量的样本测序，其并行性和高效率非常显著，如果用常规的测序技术，工作量会很大。Gharizadeh等人用此技术对67个人乳头瘤病毒(HPV)样品进行了鉴定和分型，结果证明该技术也非常适于HPV等病原体的大规模鉴定、分型和突变的研究。瑞典Uppsala大学利用焦磷酸测序技术建立了新的鉴定炭疽热细菌(Bacillus anlhracis)及其致病状态的方法，他们利用此技术分析染色体上的Ba813基因(此基因长度为277bp，在染色体上为单拷贝是炭疽热杆菌区别于其他土壤杆菌的标志)20bp的特异序列来鉴定炭疽热细菌.准确率达99.6 %，通过分析菌株是否含有两个质粒(鉴定pX0l的lef基因和pX02的cap基因)来确定炭疽热细菌的致病状态.准确率达100‰。Edvinsson B等应用焦磷酸测序技术对T弓形体虫的三个亚型进行区分，采用real-time PCR技术扩增出目的片段，在此基础上运用焦磷酸测序技术测定GRA6基因中两个单核甘酸多态性确定其分型,该技术对典型虫株的准确率达到100%,对包括非典型性虫株的分型准确率也达到81%。该技术还被应用于百日咳杆菌(Bordetella pertussis)与副百日咳杆菌(Parapertussis) 等细菌的快速鉴定及分型。

在国内，该技术应用受到越来越多研究者的重视。赵锦荣等，首先运用PCR扩增含耐药决定区一297 bp长的rpoB基因片段，借用链亲和素包被磁珠纯化单链PCR产物，设计2个正向测序引物，运用pyrosequen cing技术对耐药决定区进行序列测定.通过对一系列10倍稀释的结核分枝杆菌H，R标准株DNA进行分析，评价所建立方法的检测特异性.结果：PCR扩增后，可在2 h内得到耐药决定区序列.所建立方法的检测灵敏度为50 fg DNA/反应.在所分析的利福平敏感株中均未检测到耐药决定区突变，而在耐利福平菌株中均检测到耐药决定区突变.所建立的方法具有自动化程度高和结果准确等特点，适用于对耐利福平结核分枝杆菌进行快速高通量检测。程绍辉等，从感染人SARS病毒的Vero-6细胞中提取病毒RNA，反转录为cDNA后，PCR扩增目的基因片段，采用焦磷酸测序技术(Pyro- sequencing Technology，PSQ)进行第2601、7919、9479、119838多个碱基突变位点测序和突变频率分析。通过测序分析多个可能出现突变的位点，确定了该病毒为北京流行株，同时发现第7919位碱基发生了A/G突变。宋家武等应用该技术建立了高通量测定乙型肝炎病毒YMDD突变区的方法，经标准的YMDD突变质粒及血清标本的重复性及可靠性检测，质粒标准品的突变检出率及重复率均达100%，而血清标本达98.8%。

另外，在法医鉴定，以及SNP分析上都有应用该技术的研究报道，并且可以起到快速，准确的效果。在动物如猪的多态性分析研究中，Milan等 利用焦磷酸测序技术发现猪骨骼肌糖原含量增高与PRKAG3基因的一个不可逆转的碱基置换相关，该基因编码猪肌肉特异性的腺苷单磷酸激活的蛋白激酶异构体的调节亚单位。

优点：

1.不需要制胶，不需要毛细管，也不需要荧光染料和同位素。

2.10分钟内可分析96个样品的SNP,可满足高通量分析的要求。

3.每个样品孔都可进行独立的测序或SNP分析，实验设计灵活。

4.序列分析简单，结果准确可靠。