离子交换法分离氨基酸

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一、实验目的

学习用阳离子交换树脂柱分离氨基酸的操作方法和基本原理。

二、实验原理

离子交换层析 (ion exchange chromatography，简称ICE)是分析和制备样品混合物的液-固相层析方法，是基于待测物质的阳离子或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质的酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附原理将电解质溶液各组分分开。它是从复杂混合物体系中分离性质极为相似的生物分子 的有效手段之一。由于带电荷不同的各种物质对离子交换剂有不同亲和力，通过改变洗脱液的离子强度和pH值，控制这种亲和力，即可使这些物质依据亲和力大小顺序依次从层析柱 中洗脱下来。

氨基酸是两性电解质，分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值，各种氨基酸分子结构不同，在同一pH值时所带电荷的性质(正、负)和多少不同，与离子交换树脂的亲和力有差异，因此可根据亲和力从小到大的顺序被洗脱液分别洗脱下来，达到分离的效果。

三、仪器与试剂

(一)实验器材

(1)玻璃层析柱

(2)试管

(3)移液管

(4)恒压洗脱瓶

(5)部分收集器

(6)水浴锅

(7)分光光度计

(8)电炉

(二)材料与试剂

(1)苯乙烯磺酸钠型树脂(100~200目)

(2)2mol/L盐酸溶液

(3)2mol/L氢氧化钠溶液

(4)标准氨基酸溶液：将天门冬氨酸和赖氨酸分别配成2mg/mL的0.1mol/L盐酸溶液。

(5)混合氨基酸溶液：将上述天门冬氨酸和赖氨酸溶液按1：4比例混合。

(6)柠檬酸-氢氧化钠-盐酸溶液(pH5.8，钠离子浓度0.45mol/L)：取柠檬酸14.25克、氢氧化钠9.30克分别溶于水后混合，加入浓盐酸5.25毫升，定容至500毫升;4℃冰箱保存。

(7)显色剂：2克水合茚三酮溶于95%乙醇中，加水至100毫升。

四、操作步聚

(1)层析柱的准备：将强酸性阳离子交换树脂用氢氧化钠处理成Na+型后洗至中性，搅拌1小时后装入层析柱，使之自然降沉到一定高度，用缓冲液平衡。

(2)平衡：用pH5.8的柠檬酸缓冲液冲洗平衡离子交换柱，调节流速，收集洗脱液至4倍床体积即可上样。

(3)加样分离：将液面缓慢放至贴近层析柱表面，由柱上端仔细加入氨基酸混合液0.25~0.5毫升，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，立即加入0.5毫升柠檬酸缓冲液。待缓冲液弯月面靠近树脂顶端时，再加入0.5毫升柠檬酸缓冲液。如此重复两次，然后用滴管小心注入柠檬酸缓冲液(切勿搅动床面)。用试管收集洗脱液，每管收集1毫升，直至无氨基酸流出为止。

(4)氨基酸的鉴定：向各管收集液中加入1毫升水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中加热15分钟，冷至室温测定光密度值。以收集的管数为横坐标，以吸光度值A为纵坐标，绘制洗脱曲线。(用以已知两种氨基酸的纯溶液为样品，按上述方法和条件分别操作，将得到的洗脱曲线与混合氨基酸的洗脱曲线对照，即可确定两个峰为何种氨基酸。)

五、思考题

1.何谓氨基酸的离子交换?本实验采用的离子交换剂属于哪一种?

2.离子交换树脂用缓冲液平衡，为何又用缓冲液冲洗?实验中为什么要用pH5.8的柠檬酸缓冲液?可不可以用其它pH值的缓冲液?如果可以，应选用的pH为多少?并阐述原理。

3.茚三酮显色剂在与氨基酸显色时，是与氨基酸的什么基团反应?反应条件是什么?显色时为什么要沸水浴加热?显色原理是什么?

4.本实验分离的两种氨基酸，是否可以采用阴离子交换树脂分离，如果使用阴离子树脂，条件和结果如何?请说明原理。

5.除氨基酸外，用离子交换柱层析 法还适合分离哪些物质?为什么?