原理
测定肝素的方法主要有生物测定法、紫外分光光度法、化学法。肝素分子具有强负电性，能与带正电荷的分子结合生成复合物。天青A是一种碱性染料，和肝素生成的复合物表现出“光异色现象”，即改变染料原有的吸收光谱。控制染料浓度，在pH 8.6介质中肝素浓度低时，505 nm的光吸收与肝素浓度的关系符合朗-比尔定律。
材料与仪器
肠粘膜或猪肝
巴比妥缓冲液 阿拉伯胶 天青A 肝素
烧杯 试管 试管架 玻棒 磁力搅拌器 电炉 吸滤瓶 布氏漏斗 离心机 722分光光度计 容量瓶 真空干燥器 真空泵 水浴锅 滤纸 布袋。精密pH试纸
巴比妥缓冲液 阿拉伯胶 天青A 肝素
烧杯 试管 试管架 玻棒 磁力搅拌器 电炉 吸滤瓶 布氏漏斗 离心机 722分光光度计 容量瓶 真空干燥器 真空泵 水浴锅 滤纸 布袋。精密pH试纸
步骤
溶液配制：
1. 巴比妥缓冲液(pH 8.6，0.05 mol/L)：称取1 g氢氧化钠溶于50 ml沸水 ，再精确称取二己基巴比妥酸5052 g溶于上述溶液中，冷却后稀释至500 ml，pH计校正到pH8.6。
2. 0.1%阿拉伯胶溶液：称取0.5 g，先用少量水分散，再稀释至500 ml，过滤备用。
3. 0.1%天青A溶液(称取0.5 g，先用少量水在研钵中研磨溶解，再稀释至500 ml，过滤，冰箱储备。用时再稀释5倍。
4. 肝素标准溶液：准确称取一定量的肝素标准品，用灭菌水配成100 U/ ml的标准溶液，冰箱暂放 ，用时以水稀释100倍。
操作步骤：
1.提取（盐解法）
新鲜猪肠粘膜2 kg（或猪肝捣碎），加入氯化钠80 g（4%浓度），搅拌溶解后用40%氢氧化钠溶液调p H至9.0（用广泛pH试纸），水浴加热至50～55 ℃搅拌提取2 h，然后升温至90℃保持10 min，冷却至60 ℃用布袋过滤，取滤液待离子交换用。
2.离子交换
将滤液用水稀释3倍，加入D254树脂（氯型）120 g（按投料量6%，W/W），慢速搅拌6 h（可每隔1 h抽样测定提取液中剩余肝素的含量），过滤取树脂。
3.洗涤、洗脱
取离子交换后的树脂先用自来水洗净，而后用蒸馏水洗净。取洗净树脂加入等体积1.4 mol/L氯化钠溶液慢速搅拌1 h，过滤取树脂。继续用0.5倍体积的5 mol/L氯化钠溶液慢速搅拌2 h，过滤收集滤液（取样测含量）。树脂再加入0.5倍体积的3 mol/L氯化钠溶液，慢速搅拌1 h，过滤，滤液收集（取样测含量）。树脂再用0.5倍3 mol/L氯化钠溶液慢速搅拌2 h，过滤，滤液收集（取样测含量），合并三次洗脱滤液。
4.粗制肝素
取合并滤液加入1.5～2倍体积的95%乙醇洗一次，丙酮洗两次，真空干燥即得粗品肝素。
5.精制肝素
称取粗制肝素粉末用1%氯化钠溶液（预冷却）适量溶解，调pH1.8左右，离心15 min，上清液经砂心漏斗去除离心液表面的脂肪。悬液在水浴上加热至80～90 ℃，滴加0.0003 mol/L高锰酸钾溶液（按0.1～0.2 mol/亿单位），用滤纸法检测终点，滤液加入30%过氧化氢，调p H至11，放置36 h（冰箱内）。抽滤，滤液调pH至6.4，加入1倍体积的95%乙醇，离心，沉淀用95%乙醇洗二次，丙酮洗两次，真空干燥即得精制肝素。
6.天青法测定效价
（1）标准曲线的制作:取较大试管（易混匀）6支，以0～5编号，按下表操作。加入阿拉伯胶后必须摇匀方可加入染料，混匀后用722型分光光度计测505 nm处吸收值，以吸收值为纵坐标，单位数为横坐标绘制标准曲线。
（2）样品测定:精确称取样品约10 mg，先配成1 mg/ml溶液，再以2个100 ml容量瓶稀释为1 mg/100 ml溶液、2 mg/100 ml测定液，按下表操作并记录吸收值，分别从标准曲线上查出相应单位数，按下式计算样品效价，取平均值。
单位为U/ mg ，式中Pi 为由A 值在标准曲线上查出的单位数；V 为测定样品的总毫升数；Vi 为测定所用样品的毫升数；Sw 为称取样品的毫克数。
1. 巴比妥缓冲液(pH 8.6，0.05 mol/L)：称取1 g氢氧化钠溶于50 ml沸水 ，再精确称取二己基巴比妥酸5052 g溶于上述溶液中，冷却后稀释至500 ml，pH计校正到pH8.6。
2. 0.1%阿拉伯胶溶液：称取0.5 g，先用少量水分散，再稀释至500 ml，过滤备用。
3. 0.1%天青A溶液(称取0.5 g，先用少量水在研钵中研磨溶解，再稀释至500 ml，过滤，冰箱储备。用时再稀释5倍。
4. 肝素标准溶液：准确称取一定量的肝素标准品，用灭菌水配成100 U/ ml的标准溶液，冰箱暂放 ，用时以水稀释100倍。
操作步骤：
1.提取（盐解法）
新鲜猪肠粘膜2 kg（或猪肝捣碎），加入氯化钠80 g（4%浓度），搅拌溶解后用40%氢氧化钠溶液调p H至9.0（用广泛pH试纸），水浴加热至50～55 ℃搅拌提取2 h，然后升温至90℃保持10 min，冷却至60 ℃用布袋过滤，取滤液待离子交换用。
2.离子交换
将滤液用水稀释3倍，加入D254树脂（氯型）120 g（按投料量6%，W/W），慢速搅拌6 h（可每隔1 h抽样测定提取液中剩余肝素的含量），过滤取树脂。
3.洗涤、洗脱
取离子交换后的树脂先用自来水洗净，而后用蒸馏水洗净。取洗净树脂加入等体积1.4 mol/L氯化钠溶液慢速搅拌1 h，过滤取树脂。继续用0.5倍体积的5 mol/L氯化钠溶液慢速搅拌2 h，过滤收集滤液（取样测含量）。树脂再加入0.5倍体积的3 mol/L氯化钠溶液，慢速搅拌1 h，过滤，滤液收集（取样测含量）。树脂再用0.5倍3 mol/L氯化钠溶液慢速搅拌2 h，过滤，滤液收集（取样测含量），合并三次洗脱滤液。
4.粗制肝素
取合并滤液加入1.5～2倍体积的95%乙醇洗一次，丙酮洗两次，真空干燥即得粗品肝素。
5.精制肝素
称取粗制肝素粉末用1%氯化钠溶液（预冷却）适量溶解，调pH1.8左右，离心15 min，上清液经砂心漏斗去除离心液表面的脂肪。悬液在水浴上加热至80～90 ℃，滴加0.0003 mol/L高锰酸钾溶液（按0.1～0.2 mol/亿单位），用滤纸法检测终点，滤液加入30%过氧化氢，调p H至11，放置36 h（冰箱内）。抽滤，滤液调pH至6.4，加入1倍体积的95%乙醇，离心，沉淀用95%乙醇洗二次，丙酮洗两次，真空干燥即得精制肝素。
6.天青法测定效价
（1）标准曲线的制作:取较大试管（易混匀）6支，以0～5编号，按下表操作。加入阿拉伯胶后必须摇匀方可加入染料，混匀后用722型分光光度计测505 nm处吸收值，以吸收值为纵坐标，单位数为横坐标绘制标准曲线。
（2）样品测定:精确称取样品约10 mg，先配成1 mg/ml溶液，再以2个100 ml容量瓶稀释为1 mg/100 ml溶液、2 mg/100 ml测定液，按下表操作并记录吸收值，分别从标准曲线上查出相应单位数，按下式计算样品效价，取平均值。
单位为U/ mg ，式中Pi 为由A 值在标准曲线上查出的单位数；V 为测定样品的总毫升数；Vi 为测定所用样品的毫升数；Sw 为称取样品的毫克数。
来源：丁香实验
