气相色谱层析技术条件选择、操作方法与结果分析

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液相色谱和气相色谱技术

(一)基本原理

混合样品的气流通过固定相时，根据各组分对固定相的吸附强弱不同使不同成分得到分离。

利用气相色谱 层析技术做为微生物诊断的工具已成功地用于微生物的分类和鉴定。该法敏感性强，能够分离和检测到毫微克的水平。它具有快速的特点，常在数十分钟甚至数小时就可以对传染病做出早期诊断。其结果稳定，重复性好，但不足之处是操作中各因素不易控制，方法不易标化等。

(二)气相色谱仪 的基本部件

1. 载气 常用的载气主要有氮、氩、氢和二氧化碳等。这些气体一般都由高压气瓶供给。

2. 进样器 气相色谱仪 可以用于分离固相、气相和液相标本。液相标本采用微升注射器穿过橡皮隔片注入，气相标本采用特种气相注射器注入。

3. 谱柱及加热炉 色谱柱一般由金属或玻璃制成，通常采用的柱长2m~4m，内径2mm,毛细管柱长度可达20m～150m，内径为0.2mm。

载体 一般采用惰性、多孔的固体颗粒。多由硅藻土或玻璃珠制成，分析不同极性的微生物化合物，为了获得最适的分离条件，要求有不同固定相的载体。目前比较常用的载体有：聚乙二醇(CarbOwax 20M)、F F A P(聚乙二醇20M和2-硝基对苯二甲酸的反应产物)，OV—17(苯基甲基硅酮)。OV-210、SE-30(甲基硅酮)、Chromosorb G(白色硅藻土载体)等。柱加热炉在温度控制上是非常重要的。

4. 纪录仪

5. 数据处理装置 一般均附有数据处理计算机。

气相色谱仪 的基本流程图如下图1-1：

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图1 气相色谱仪的基本流程

(三)试验条件的选择

1. 色谱柱的选择 要注意极性及最高使用温度，柱温不能超过最高使用温度。固定相按极性相似的原则选择。

色谱柱的内径大小、长度都能影响分离率。一般而言，内径越小，长度越长，分离效果越好，一般柱长为1m～5m(毛细管柱则20m～100m)。

填充剂颗粒一般采用40目～60目，60目～80目及80目～100目大小。长柱子宜用粒度大些的，以减少柱压降，短柱子则用粒度细的。

气相色谱中固定液的含量对分离效率的影响较大。一般采用固定液与载体重量之比为15︰100～25︰100。采用高灵敏度的检测器，由于进样量减少，固定液含量可以降至5︰100以下。这样可以使用较低柱温，从而提高柱效，缩短分析时间。但固定液用量太少会引起吸附。

2.柱温选择 柱温选择对分离度影响很大，常是条件选择的关键。选择的基本原则是：在使最难分离的组分有尽可能好的分离高度的前提下，尽可能采取较低温度，但以保留时间适宜及不拖尾为度。

⑴ 高沸点混合物(200℃～400℃)，若需在较低的柱温下分析，可采用低固定液配比1%～3%，采用高灵敏检测器，柱温可比沸点低100℃～150℃，在200℃～250℃的柱温下分析。

⑵ 沸点<300℃的样品，可用3%～25%固定液配比。沸点越低，所用配比越高，柱温可比平均沸点低50℃至平均沸点的范围选择。

3.载体选择 载体采用低线速时，宜用氮气;高线速时用氢气。柱越长，柱内有较大压力降，宜用氢气。载气采用低线速时为20ml～80ml/min。

4.其它条件

⑴ 气化室温度及检测室温度选择：气化温度取决于样品的挥发性、沸点、稳定性以及进样量，一般选择稍高于样品沸点，但不要超过沸点50%以上，以防分解。检测室温度需高于柱温，一般高于柱温30℃左右或与气化室同温。

⑵ 进样量：固定相在配比15%～35%的层析柱时，最大进样量液体为10&mu;l，气体为10ml。一般样品量液体4&mu;l，气体为0.5ml～3ml，固体小于1mg。

⑶ 桥电位选择：散热多和选择大的桥电位，在灵敏度相同的情况下，应尽量选择低桥电位，以保护热敏元件。

(四)填充柱的制备

1.称取一定量的载体于蒸发皿中，加2倍于载体体积的低沸点溶剂(氯仿丙酮、三氯甲烷等)，使之溶解。

2.取适量的固定液，倒入蒸发皿中，拌匀。注意应使载体全部覆盖在液面下，于红外灯下缓缓加热，不时轻轻搅拌，待溶液全部挥发。

3.先将柱的一端用玻璃毛轻轻堵上，接上吸滤真空泵，柱的另一端接上漏斗，将填充剂从漏斗加入，同时启动真空泵，不时轻敲柱子各部，以使填充均匀。装满后，关闭真空泵，取下色谱柱，将加样的一端也填上一小团玻璃毛。

4.将柱装入色谱柱中，在通载气前，先将炉温升至略高于操作温度，保持约1h，以使固定液受热熔化或粘度减小，在载体表面流布均匀，然后再通入载气，使色谱柱在操作温度下，通载气数小时。

(五)样品处理

以细菌培养物样品的处理为例。

1.取3～5个菌落，接种于2ml含有3%葡萄糖TSB肉汤(即含胰酶1.42%、植物胨 0.25%、K2H PO4 0.25%NaCl、0.42%的肉汤)内，35℃～38℃培养3h。

2.于培养物中加2ml 5Mol/L H2SO4、H2O和CH3OH(1︰3︰16)，混合后，再加4ml醋酸乙脂浸取，混匀，静置片刻。

3.4 000r/min离心15min，弃沉淀。

4.取上清液加等量乙醚提取，收集乙醚层。

5.于水层中再加上述比例的5 Mol/L H2 SO4、H2O和CH3OH混合物。

6.于混合物中加等量氯仿提取，分层，收集氯仿层，弃去水层。

7.将乙醚层与氯仿层合并，挥发浓缩至0.01ml,加10&mu;g已二酸作内标物，再加20&mu;g甲氯基胺-HCl。

8.于混合物中加0.2ml吡啶，再加0.2ml TRI-SIL-BSA和0.05ml TMOS，混匀，60℃孵育1h，离心，去沉淀。

9.上清即可制谱。

(六)操作方法

1.按流程图并参考仪器使用说明书，将有关设备安装好，检查各系统各接头是否漏气，确定无误后，可开始操作。

2.打开气流总阀门，调节表头上的减压阀，使气体压力为22kg/cm2左右，调节稳压器针形阀，使载气流速控制在所需要的流速值。

3.加热色谱柱至所需的柱温并控制此温(根据仪器恒温箱的性能控制温度波动值在一定的范围之内，如±0.5℃)。一般所用的柱温是在被分析物质的平均沸点左右或更低一些。若被分析物的沸程太宽，则可用程序升温法来升高柱温。

4.加热进样器(气化室)，使温度高于样品沸点的最高组分的沸点。

5.加热检测器恒温箱，使温度与柱温一样或高于一定的值。

6.气流和温度均达稳定后，给检测器通电流。若采用氢火焰离子化检测器则启动微电流放大器部分。

7.调检样器为零点，待稳定后，即可开始进样。

(七)结果分析

气相色谱层析是一种分离分析的方法，因此它的特点是适合于多组分混合物的定性和定量分析。

1.定性 对于一已知范围的混合物，用此法定性很容易，但对于范围未知的混合物来说，则需要配合化学分析及其它仪器分析等。

⑴ 利用保留值定性法：同一种物质在一根层析柱上保留时间相同。取样品各可能组分的纯物质加入样品中，混合进样，对此加入后的色谱图，若某色谱峰相对谱高，则该色谱峰的组分与纯物质可能为同一物质。

⑵ 化学反应定性法：即把色谱柱的流出物，通过官能团试剂中，观察试剂的颜色是否发生变化或是否有沉淀，而判断该组分含什么官能团或属于何类化合物。

⑶ 两谱联用定性法：即利用质谱仪、红外分光光度计等来进行测定，定性。

2.定量 在实验条件恒定时，峰面积或峰高与组分的含量成正比，因此可以利用峰面积或峰高面积或峰高来进行定量。对于微生物标本的气相色谱分析常根据以下几点来进行比较。

⑴ 峰的有无和峰的大小。

⑵ 按10个重复标本分析计算的平均t值(标准差)。

⑶ 同标准化合物的相对保留时间进行对比，而对某化合物做出鉴定。