多酚氧化酶(PPO)的纯化和活力测定
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很多植物 受到机械损伤时在空气中会逐渐变成褐色,这是损伤时植物细胞破碎,原来彼此分开的多酚氧化酶和多酚类物质接触反应的结果。反应如下:
多酚氧化酶(po1yphenoloxidase,PP0)是一种含铜酶,它能够催化酚类物质转变成醌。近几十年来,国内外对植物 组织褐变的研究表明,组织的褐变主要是PP0作用于天然底物酚类物质所致。
一、试剂
0.025mol/L磷酸钾缓冲液( pH7.2);0.15mol/L儿茶酚溶液;10mmol/LTris-HCl溶
液(pH8.3);硫酸铵。
二、材料
梨
三、器材
组织匀浆机,漏斗,滤纸,分光光度计 。
四、操作方法
(1)多酚氧化酶(PP0)的提取
1. 丙酮粉制备:取果肉组织100 g,加入200mL冰丙酮(—20℃左右),用高速组织捣碎机匀浆5min,混合液用中速滤纸在漏斗架上过滤,残渣用冰丙酮反复冲洗,过滤,直至成为白色粉末,此粉末即为丙酮粉。
2.酶液制备:称取1g丙酮粉,加入20ml 0.025mol/L磷酸缓冲液 ( pH7.2),0℃下用磁力搅拌器匀浆30min,在12 000rpm下离心30min,取上清液,得粗酶提取液。
(2)多酚氧化酶(PP0)的纯化
向上述酶液中加入NH4SO4至为80%饱和溶液, 搅拌30min, 过夜,于12 000g离心30min,沉淀溶于0.025mol/L磷酸缓冲液 中(pH7.2), 对10mmol/LTris-HCl溶液(pH8.3)透析18h, 期间更换三次,即为纯化多酚氧化酶。
(3)多酚氧化酶(PP0)活力的测定
以儿茶酚为底物,在1cm的比色杯中加入2.75mL 0.025mol/L磷酸缓冲液中(pH7.2), 0.1mL 0.15mol/L儿茶酚溶液,混匀,室温下放置3分钟后,加入0.1mL酶液, 5s后开始扫描1min内A420值的变化,酶活性以每分钟光吸收值改变0.001所需的酶量为1个活力单位。
五、注意事项
多酚氧化酶易失活,提取酶时宜在低温下进行。