多酚氧化酶（PPO）活性的测定

多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PP0）广泛存在于植物组织中，可以氧化酚类物质为醍类物质，但在正常组织中这一反应并不经常发生，如果组织受损，反应便可发生，如苹 果、茄子创面的褐变。另外，当植物感病时，多酚氧化酶活性明显升高。因此，酚类物质含量和多酚氧化酶活性测定是植物抗性生理研究中经常用到的一个指标。本实验的目的在于学习测定多酚氧化酶活性的方法、原理及操作技术。

多酚氧化酶催化分子态氧将酚类化合物如邻苯二酚（儿茶酚）氧化为醍类物质， 所生成的产物（邻醍）在525 nm波长处有最大吸收峰，其吸光值与产物生成量呈正相关，所以可据此测定多酚氧化酶的活性。

材料：马铃薯块茎等。

试剂： 0.5 mol · L^-1 pH 5.5磷酸缓冲液，0.1 mol · L^-1邻苯二酚溶液，20% 三氯乙酸。

器材：分光光度计，离心机，研钵，容量瓶，试管等。

多酚氧化酶（PPO）活性的测定的基本过程可分为如下几步：

1. 酶液提取：取5 g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中。加适量磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，3 000 r · min^-1离心10 min,上清液转入25 mL 容量瓶中。沉淀用5 mL磷酸缓冲液再提取2次，上清液并入容量瓶，定容至刻度。低温下保存备用。

2. 酶活测定：取4支试管（2支对照，2支测定）按表41 -1加入试剂。37°C水浴中保温 10 min,到时间后立即加入2 mL 20% 的三氯乙酸，终止酶的反应。反应液4 000 r ·min，离心10 min，收集上清液，并适当稀释，于525 nm波长下测定其吸光值。

3.结果计算：多酚氧化酶活性单位（U）定义为1 g鲜样1 min内吸光值变化0.01所需的酶量。

式中：△A—反应时间内吸光值的变化；

W—实验材料鲜重，g；

t一反应时间，min；

D一稀释倍数。

植物样本在处理前勿碰伤搓揉。