淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体制备方法

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1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫 的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫 、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

一、细胞融合前准备

(一)　免疫 方案

选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原 的特性不同而定。

1.　颗粒性抗原 免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:

　　　　　　　　　　初次免疫　　　　　　　1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)
　　　　　　　　　　　　↓　2～3周后
　　　　　　　　　　第二次免疫　　　　　　1×10７／0.5ml ip
　　　　　　　　　　　　↓　3周后
　　　　　　　　　　加强免疫(融合前三天)　1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)
　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　　取脾融合
 

2.　可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

　　　　　　初次免疫　 Ag　1～50μg　加福氏完全佐剂皮下多点注射
　　　　　　　　│　　　　　(一般0.8～1ml　0.2ml／点)
　　　　　　　　↓3周后
　　　　　　第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip
　　　　　　　　│　　　　　　　(ip剂量不宜超过0.5ml)
　　　　　　　　↓3周后
　　　　　　　第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip
　　　　　　　　│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)
　　　　　　　　↓2～3周后
　　　　　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv
　　　　　　　　↓3天后
　　　　　　　取脾融合
 

取脾融合

目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

(二)　饲养细胞

在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。