胰蛋白酶的提取实验原理/试剂配制/步骤

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[原理]

在动物胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶性质相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。在胰蛋白酶提取过程中，三者彼此很难分开。需采用合适的方法进一步分离纯化。

从动物胰脏中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH值调至酸性(pH3.0左右)，使大量的酸性蛋白沉淀出来。经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原沉淀。沉淀物经水溶解并调至pH8.0，用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活，同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原也被激活，三种酶原相互作用过程如下：

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也可采用从胰脏中提取出胰蛋白酶原，利用合适的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶，并通过溶液中Ca2+的环境，使胰蛋白酶原被开始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活，转变为具有活性的胰蛋白酶(胰凝乳蛋白酶原及弹性蛋白酶原亦同时被胰蛋白酶激活成有活性的酶)。

激活后的酶溶液再进一步分离纯化。

[试剂和器材]

1、试剂

(1)pH2.5～3.0乙酸化的水溶液

(2)10%(体积分数)乙酸

(3)2mol/L硫酸

(4)固体硫酸铵

(5)无水CaCl2

(6)结晶胰蛋白酶

(7)25%乙醇溶液(含0.015mol/LHCl 、0.05mol/LCaCl2)

(8)95%(体积分数)乙醇

(9)5mol/L NaOH

(10)丙酮

2、器材

(1)胰脏

(2)组织捣碎机

(3)离心机

(4)磁力搅拌器

(5)透析袋、20目筛网、纱布、水浴锅

(6)烧杯、量筒、刻度吸管、试管、玻璃漏斗

(7)布氏漏斗、抽滤瓶、温度计、滴管、玻璃搅棒、纱布、pH试纸等

[方法和步骤]

方法一

1、 胰蛋白酶原的提取

取新鲜胰脏约150g，剥去结缔组织和脂肪，取净重100g，切成碎块，在组织捣碎机中捣碎，并加入2倍体积预冷的pH2.5～3.0乙酸化水溶液，制成匀浆。浆液倒入500mL烧杯中，用10%(体积分数)乙酸调节pH在2.5～3.0之间，在5～10℃下提取6h以上，并间隙轻轻搅拌。用4层纱布过滤，尽量挤出滤液。组织残渣中再加入0.5倍体积(约50mL左右)预冷的pH2.5～3.0乙酸化水溶液再提取一次(放置1～2h)，再用4层纱布过滤。合并两次滤液，用2.5mol/L硫酸调节滤液pH在2.5～3.0之间，4℃放置4h(pH始终保持在2.5～3.0)，使提取液中酸性蛋白沉淀析出。提取液用折叠滤纸于玻璃漏斗中自然过滤，收集滤液，量取体积(约200mL左右)。

滤液中加入粉末状固体硫酸铵，使溶液达0.75饱和度(每升滤液加492g，5℃)。放置过夜，使胰蛋白酶原完全析出。次日抽滤，弃滤液，压紧并收集滤饼，即胰蛋白酶原粗品。

2、 胰蛋白酶原的激活

将胰蛋白酶原粗品称重(湿重)，分次加入10倍体积预冷的蒸馏水(按滤饼重量计算)，使滤饼完全溶解(一般情况滤饼中硫酸铵含量约占饼重1/4)。用5mol/L NaOH将溶液调至pH8.0，慢慢地搅拌下加入固体无水CaCl2使溶液的Ca2+终浓度达到0.1mol/L(要减去一部分氯化钙与硫酸铵结合生成硫酸钙的钙离子)。取出2mL溶液用于测定激活前的蛋白含量及酶活性。原溶液中加入5mg结晶胰蛋白酶，轻轻搅拌均匀，25℃放置2～4h，或4℃放置12～16h，使胰蛋白酶原活化。每隔1h取样测定胰蛋白酶活性 增长情况，直至酶激活速度变慢或停止增长。一般比活可达到3 500～4 000 BAEE单位/mg。留取2mL溶液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性。激活酶溶液用2mol/L硫酸调pH至2.5～3.0，滤纸过滤，滤去硫酸钙沉淀，收集滤液，4℃保存备用。

方法二

称取冷冻猪胰脏100g，在2～5℃下解冻，切成小块，用组织捣碎机中绞碎成胰浆，在5～10℃存放24h以上，使胰酶自身活化。胰浆中加入25%(质量分数)乙醇溶液250mL(25%乙醇溶液中加0.015mol/L HCl 、0.05mol/L CaCl2)，捣碎机中捣碎1min。胰浆倒入500mL烧杯中，间隙搅拌，温度20℃左右，活化5～6h。每隔1.5h，吸取2mL活化液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性。

活化反应结束后，胰浆3 500 r/min离心20min，将离心后上清液用二层纱布过滤。滤液置250mL烧杯中，以过滤清液的体积为准，加入粉末状硫酸铵，搅拌溶解，使溶液硫酸铵饱和度为20%。放置 6h后，3 500 r/min离心20min，保存上清液待用，取沉淀。沉淀分别用适量95%乙醇洗涤过滤，再用丙酮洗涤，过滤。最后将沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅰ。

在上述离心上清液中，加入粉末状硫酸铵，搅拌溶解，使上清液溶液达到55%硫酸铵饱和度，放置 6h后，3 500 r/min离心30min，取离心沉淀，分别用适量95%乙醇、丙酮洗涤，过滤后将沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅱ。