DNA连接实验原理与步骤

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DNA分子的体外连接就是在一定条件下， 由DNA连接 酶催化两个双链DNA片段组邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程， DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。

带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中，但是在连接反应时，外源DNA和质粒都可能发生环化，也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸(未脱磷)，可形成4个新的磷酸二酯键;如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组 DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。

1、不对称粘性末端：两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率;载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留;非重组 克隆的背景较低;外源DNA可以定向插入到载体中。

2、对称性粘性末端;线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理;载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留;重组 质粒会带有外源DNA的串联拷贝;外源DNA会以两个方向插入到载体中。

3、平端：要求高浓度的DNA和连接酶;载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失;重组 质粒会带有外源DNA的串联拷贝;非重组克隆的背景较高 。

粘性末端连接：

实验试剂：

用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并(或)用碱性磷酸酶处理质粒DNA。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。

10×T4DNA连接酶buffer(该缓冲液应分装成小份，贮存于-20℃。)：200mMTris-HCl(pH7.6);50mMMgCl2;50mM二硫苄糖醇;

500μl/ml BSA(可用可不用)

T4DNA连接酶

5mM ATP

实验步骤：

1、在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：

1) 10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子(一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5)，补足ddH2O 至8μl。

2) 轻轻混匀，稍加离心，于45℃水浴5分钟使重新退火的粘端解链， 迅速将混合物转入冰浴。

3) 加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl。

2、盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心5秒。

3、12℃下过夜连接反应。

4、反应结束后于-20℃保存。

5、再设立两个对照反应，其中含有(1)只有质粒载体;(2)只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒DNA，并尽可能多加外源DNA，同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。

注意事项：

1、连接反应的温度：DNA连接酶的最适反应温度为37℃，但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是12℃过夜。

2、DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。

3、 碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其5’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。

4、连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。

5、如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。