DNA的酶切原理试剂和方法步骤

一、实验原理
 
DNA重组技术的第一步是从不同来源的DNA上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。
目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质的不同可分为三大类，分别为I、II和III类：I类酶识别部位和切点不同，切断部位不定；III类酶的识别部位和切点不同，但切断特定部位；II类酶切断识别部位或其附近的特定部位，酶切后的双链DNA的末端是粘性末端，某些限制酶产生平末端。因此，应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II类酶，现在市场上销售的酶都属于II类酶。
 
二、实验 试剂
DNA样品（基因组和胆盐水解酶基因连接T载体的重组质粒）， 限制性内切酶 ，酶切缓冲液（购酶时附），无菌双蒸水。
 
 

ask.bbioo.com
 
单酶切质粒和基因组体系

酶切体系	目的片段	质粒载体
10×Buffer	2μL	2μL
DNA	5μg	1μg
Eco RI	1μL	1μL
ddH 2 O	补齐20μL	补齐20μL

 
 
五、 实验注意事项
 
 

1. 反应温度：常规酶切反应在37℃进行，但有些酶的最佳反应温度并不是此温度，如 Sma I，最适反应温度为30℃，故最好根据所选用的酶来确定反应温度。当采用联合酶切进行实验时，尤其要注意选择的反应温度是否都满足两者的要求，如果有一个酶的最适温度不符，建议分步酶切。
2. 缓冲体系：按盐离子浓度可将缓冲溶液分为三类：高盐、中盐和低盐。缓冲液配制为10×母液，酶切时稀释10倍。常规酶切中均选用最佳缓冲液进行酶切反应，但联合酶切时，根据厂商提供的联合酶切缓冲液选择表选择缓冲液或采用万能缓冲液。
3. 反应时间：常规酶切反应时间为1.5 小时，但可根据酶切对象和酶的用量将保温时间延长2～3 小时，有时甚至可以过夜。一般来说，在DNA 量固定的前提下，长时间酶切所需的酶量可适当减少，所以在大剂量酶切DNA 时，可以考虑酶切过夜。
4. 加入酶量：实验中常常出现酶量加入过多酶切效果反差的现象，这主要是酶的贮存液中含有50％的甘油，但酶量加入过多，超过酶反应体系的10％时，过多的甘油抑制了 限制性内切酶 活性。因此，在酶切反应时，酶量的加入原则：不超过反应总体积的10％，在能切开的条件下加入越少越好（可减少酶的Star 活性）。
5. DNA 纯度：DNA样品中常含有蛋白含量过高、有机溶剂（苯酚或氯仿）残留、高浓度的RNA 等杂质影响酶切；DNA 浓度过高会导致酶切失败，一般DNA 的质量浓度在1μg/μl 体系中能取得好的酶切效果。当发生不明原因的酶切失败时，常用的解决方法是采用稀释酶切，即将酶切体系放大，将杂质相对浓度稀释，这样不需增加酶量就能取得较好的酶切效果。