酵母双杂交实验项目操作及心得体会
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1.构建CaM诱饵质粒
① PCR 扩增CaM基因的开放阅读框，正向和反向引物分别加接酶切位点。
② 扩增得到的CaM插入T载体 ( T–CaM) 。
③ T–CaM和pGBKT7 质粒 分别双酶切。
④ 胶回收目的DNA。
⑤ 将CaM连入pGBKT7，构建成表达载体 pGBKT-CaM，转化大肠杆菌DH5α。
⑥ 因pGBKT7含Kan+抗性基因，在Kan+抗性平板上筛选阳性克隆。
⑦ 测序验证CaM与gal4 DNA 结合功能区融合，插入序列读框正确、无碱基突变。
2.pGBKT7 – CaM转化酵母菌Y2HGold
将pGBKT7- CaM采用PEG/LiAc法转化酵母菌Y2HGold，涂布于SD – Trp固体培养基上，30° C 3-5天，菌落长出。
进行CaM自激活鉴定及毒性测定。
3.龙须菜高温胁迫表达cDNA文库构建
① 设定温度梯度(26-35°C)和时间梯度(12-72 h)，对龙须菜进行高温胁迫。
② 提取龙须菜总RNA(RNA提取按照Qiagen试剂盒说明书进行，RNeasy Plant Mini Kit，Qiagen)。
③ 应用SMART技术构建龙须菜高温胁迫表达cDNA文库，3’和5’引物分别加接酶切位点。
4.文库筛选载体构建
将龙须菜高温胁迫表达文库cDNA双酶切，连入同样双酶切的AD 克隆质粒pGADT7中，用PEG/LiAc 转化法将cDNA 文库质粒转化到酵母菌Y187中，SD – Leu平板上30 ℃培养3～5 天，菌落长出。
5.酵母交配转化及阳性克隆的筛选
将酵母菌Y187/ pGADT7-cDNA与酵母菌Y2HGold/pGBKT7- CaM进行酵母交配转化(Yeast Mating)，SD–Trp/-Leu/Aba/X-α-gal平板上30 ℃培养3～5 天，筛选蓝色菌落，再将阳性克隆在SD–Trp/-Leu/-His/-Ade/Aba/X-α-gal平板上进行验证。
6.阳性克隆质粒的提取和保存
提取阳性克隆酵母菌的质粒，转化至大肠杆菌E.coli DH5α中，因pGADT7质粒含Amp+ 抗性基因，在Amp+抗性平板上筛选阳性克隆AD- X(X代表阳性克隆中携带的龙须菜cDNA，即为初步筛选得到的相互作用蛋白质的cDNA)。
7.阳性克隆的再验证
pGBKT7 –CaM 与AD–X质粒共转化酵母菌Y2HGold，重新验证相互作用消除假阳性。按表1组合，转化后的酵母菌涂布于SD–Trp/-Leu/-His/-Ade/Aba/X-α-gal平板上，30 ℃培养5～7 天，筛选蓝色克隆而且无自激活性的蛋白即为相互作用的蛋白。
表1 阳性克隆再验证的质粒组合方案
| 质粒组合 | 检测目的 |
| pGBKT7 –CaM + AD–X | 阳性重检 |
| pGBKT7 + AD–X | AD–X自激活性检测 |
| pGBKT7 - Lam+ pGADT7 | 相互作用阴性对照 |
| pGBKT7 - 53+ pGADT7 - T | 相互作用阳性对照 |
8.对相互作用蛋白X进行测序和序列分析
以pGADT7载体引物对AD–X进行测序，测序结果与NCBI GenBank数据库进行BLAST分析和序列结构分析。
心得经验：
酵母双杂交系统对于研究蛋白与蛋白之间的相互作用虽然具有筛选量大、效率高及应用广泛等优点，但有它自身的缺陷。酵母培养的周期与大肠杆菌相比较长，酵母转化的过程较繁复，耗时较长，而且存在假阳性较多的问题，阳性克隆工作量太大，验证工作繁重。在此项目中酵母双杂交实验最关键的步骤是酵母培养时间的掌控。在吸取5uL转入含50mL YPDA液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃120rpm/min振荡培养的步骤中其OD600达到0.15-0.3(16-20h)很重要，这关系到酵母细胞的浓度及生长状态。且下一步把沉淀下来的酵母细胞转入含100mLYPDA液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃120rpm/min振荡培养达到其OD600达到0.4-0.5(3-5h)同样重要。在这3-5h培养的原因是让细胞至少完成两次分裂，而且在细胞3-4次分裂间，转化效率恒定。在酵母交配实验中，30 ℃、80r/min恒温振荡培养时间20-24h也甚为重要，培养时间应由在显微镜下是否能看到米奇头形状的杂交细胞为准，如果没有观察到杂交细胞，应适当延长培养时间，而如果观察到，应停止振荡培养，防止杂交细胞增殖，增加筛选工作量。培养酵母菌Y2HGold/pGBKT7- CaM(SD/-Trp)时，出现了酵母菌种从第四天开始出现变红的情况，查找资料得知是由于酵母菌在缺乏腺嘌呤的生长环境中，产生红色代谢物的导致的。因而应尽量缩短此步的培养时间。本项目用变红的菌进行下一步的步骤，实验结果并没有受影响，且变红的菌在腺嘌呤丰富的YPDA液体培养基中培养时，后代菌种恢复白色。综上，酵母培养时间的控制是酵母双杂交实验成功的关键。
