BrdU法细胞周期检测实验原理与操作步骤

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细胞周期 测可以反应细胞增殖的速度，细胞周期测定的方式有很多，这里总结下BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)渗入法测定细胞周期的原理与操作步骤。

一、原理

细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂 结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。

单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

测定细胞周期 的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等，这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。

BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)加入培养基后，可做为细胞DNA复制 的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。

二、仪器、用品与试剂

1、仪器、用品：同常规细胞培养

2、试剂：BrdU(1.0mg/ml)，甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

三、操作步骤

1、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10μg/ml。

2、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

4、常规染色体制片(见第三部分：染色体技术)。

5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。

6、弃去2×SSC液，流水冲洗。

7、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。

8、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。

9、计算：

细胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小时)

附：(1)BrdU配制: BrdU 10mg十双蒸水10ml 4℃下避光保存。

(2)2×SSC配制: NaCl 1.75克，柠檬酸三钠•2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。

注意事项：BrdU溶液需要避光保存在 4℃冰箱，SSC溶液也需要4℃保存，可根据实验需要分装后高压灭菌。