流式细胞仪之细胞凋亡检测的PI双染色法

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流式细胞仪是检测悬浮的单细胞或微粒的信号分析技术，被誉为实验室的“CT”，可用于细胞凋亡检测、细胞分选、单细胞内细胞因子表达分析等。这里简单介绍下流式细胞仪检测细胞凋亡的两种方法。

第一部分 流式细胞仪检测细胞凋亡:Heochst 33342/PI双染色法

一、基本原理

经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降.细胞一经固定就不再是活细胞,而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响.因此发展了用 “细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测方法.这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色,且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多.流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”,因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞.活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用.Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高,Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关,凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变,但细胞膜的通透性已有增强,因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多.此外,还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关.既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易,而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中,即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染,坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损,可被这些染料染色.根据这些特性,用Hoechst 33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色,就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来.在双变量流式细胞仪的散点图上,这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色(Hoechst 33342+/PI+),凋亡细胞为高蓝色/低红色(Hoechst 33342++/PI+),坏死细胞为低蓝色/高红色(Hoechst 33342+/PI++).

二、试剂与仪器

1、Heochst 33342 染液：用PBS配成10ug/ml的储存液浓度,4℃避光保存

2、PI染液：用PBS配成5ug/ml浓度,4℃避光保存

3、400目的筛网

4、流式细胞仪

三、实验步骤

1、悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst 33342 ,终浓度为1ug/ml; 37℃孵育7—10min.

2、低温500 ~ 1000r/min离心5min弃去染液.

3、加入1.0ml PI染液,4℃避光染色15min.

4、400目的筛网过滤1次.

5、流式细胞仪分析：Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光,激发光波波长为352nm,发射光波波长为400 ~ 500nm,产生兰色荧光;PI用氩离子激光激发荧光,激发光波波长为488nm,发射光波波长大于630nm,产生红色荧光.分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图.

6、结果判断：在兰色荧光对红色荧光的散点图上,结果为：正常细胞为低蓝光/低红光,凋亡细胞为高蓝光/低红光,坏死细胞为低蓝光/高红光.

四、注意事项

1、在红色荧光对兰色荧光散点图上,还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹,可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故.

2、用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长,一般控制在20min之内为宜.如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移,导致红色荧光与兰色荧光的比例改变,从而影响结果的判断.

第二部分 流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin V/PI双染色法

一、基本原理

细胞凋亡

早期改变发生在细胞膜表面,目前早期识别仍有困难.这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面.PS是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外.Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性.对PS有高度的亲和性.因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS.PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中.两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了.因此,可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法.

二、试剂与仪器

孵育缓冲液：10mmol/L HEPES/NaOH,PH 7.4,140mmol/L NaCl,5mmol/L CaCl2

标记液：将FITC- Annexin V(宝灵曼公司产品)和PI加入到孵育缓冲液中,终浓度均为1ug/ml

流式细胞仪

三、实验步骤

1、细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中,每样本细胞数为(1~5)×106,/mL　500~1000r/min离心5min,弃去培养液.

2、用孵育缓冲液洗涤1次,500~1000r/min离心5min.

3、用100ul的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育10~15min.

4、500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次.

5、加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min,避光并不时振动.

6、流式细胞仪分析：

流式细胞仪激发光波长用488nm,用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光,另一波长大于560nm的滤器检测PI.

7、结果判断：

凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性,坏死细胞则不能.细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生.因此,在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号.正常活细胞与此相似.在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(FITC+/PI+);而右下象限为凋亡细胞,显现(FITC+/PI-).

本文总结了流式细胞仪检测细胞凋亡的Heochst 33342/PI双染色法和Annexin V/PI双染色法的基本原理、试剂与仪器以及实验方法和操作步骤。