DNA的限制性酶切与琼脂糖电泳
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限制性内切酶可特异性的识别DNA序列上特定的核苷酸序列位点,一般购买限制性内切酶说明书上都会有一定的反应体系,酶切体系在一定温度放置一定时间后,需要进行DNA琼脂 糖电泳验证或者回收酶切效果。
实验原理
1、DNA的限制性酶切
限制性内切酶 特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上,并在此处切割双链DNA。它可分为3类。I类和III类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰(甲基化)作用和依赖ATP的限制(切割)活性(双功能酶),II类修饰-限制系统是由两种酶分子组成的双元系统:一种为限制酶,它切割某一特异的核苷酸序列,另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。分子生物学中常用的就是II类。
绝大多数的II类限制酶识别长度为4~8个核苷酸 且呈二重对称的特异序列。EcoRI的识别序列是G↓AATTC,BmHI的识别序列是G↓GATCC,HindIII的识别序列是A↓AGCTT。
限制性内切酶 是一类非常昂贵的试剂,使用过程中要仔细利用并有严格的计划。每种限制性内切酶都有特定的反应条件,如特别的pH范围,缓冲液组分,温育温度等,具体的使用也可参考有关的工具书或文献或产品说明。一般温度37℃,pH7.5~8.0对大多数酶来讲是适合的,但缓冲液的组分则变化很大,典型的组分应有Tris、NaCl、MgCl2,和巯基试剂(如巯基乙醇或二硫苏糖醇)。
典型的反应体系中包括lμg或更少的DNA和1单位酶以及合适的反应介质。反应总体积通常控制在20和50ul之间,反应时间在1小时,而反应的终止则由EDTA 溶液的加入完成,因为它能鳌合核酸酶活性所必需的金属离子。
2、DNA的琼脂糖电泳
DNA的电泳有琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳,它们是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。
DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子在电场中通过凝胶介质中而泳动,除电荷效应外,凝胶介质还有分子筛效应,与分子大小及构象有关。由于DNA分子或DNA片段的分子量差别,电泳后呈现迁移位置的差异。琼脂糖凝胶电泳所需样品量仅0.5~1ug。琼脂糖凝胶对DNA的分离范围较广,用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至50kb的DNA。而分离小片段DNA(5~500bp)则需采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,其分辨力极高,能分离相差1bp的片段。
电泳过程中或电泳完毕直接利用低浓度的荧光染料EB(溴化乙啶)进行染色,EB是一种扁平分子,可以嵌入核酸双链的配对碱基之间,在紫外线激发下,发出红色荧光。即可确定DNA条带在凝胶中的位置,而且灵敏度相当高,少至1~10ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。
不同浓度琼脂糖凝胶分离的范围
<center> <img alt="DNA的限制性酶切与琼脂糖电泳" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377590518.jpg" /></center>试剂:
(1)1 X TAE电泳缓冲液:45mmol/Ltris-硼酸,1mmol/LEDTA,pH8.0
(2)凝胶加样缓冲液:0.25%溴酚蓝,40%蔗糖水溶液。
(3)λ-DNA和提取的DNA
λ-DNA是λ噬菌体的基因组DNA,全长50kb。用HindIII或(和)BamHI酶切得到的片段被广泛用于DNA电泳的分子量标准。
(4)分子量标准(λ-DNA/HinD III)
(5)限制性内切酶。
操作方法
1、 DNA的限制性酶切
(1) 取1只1.5mL离心管,按下列顺序加入:
DNA:
5uL
10 X buffer:
2uL
蒸馏水:
12uL
限制酶:
1uL
(2)轻轻摇匀,置于37℃保温1小时。
(3)加入4uL加样缓冲液,摇匀。
(4)取10uL进行电泳
2、 DNA的琼脂糖凝胶电泳
(1)将电泳槽彻底洗净。
(2)将电泳槽置于平整的台面上并调节水平。
(3)用2%琼脂糖封固胶模边缘,任其凝固。
(4)配制1X TAE电泳缓冲液。
(5)用1X TAE 电泳缓冲液配制0.8%的琼脂糖,微波炉加热使之溶解。
(6)待琼脂糖溶液冷至60℃时,缓缓倒入胶模,厚约0.5mm。
(7)立即插入梳子,静待琼脂糖凝固。
(8)去掉封固的有机玻璃封条,将胶模放进电泳槽。
(9)向电泳槽倒入1X 电泳缓冲液,没过凝胶5mm。
(10)小心地拔掉梳子。
(11)用20uL的枪吸取DNA溶液,缓缓注入点样孔。
(12)按marker、限制酶酶切的DNA、提取的DNA依次点样
(13)接通电源,电泳。
(14)电泳完毕,取出胶模,将胶置入EB染色液中染色0.5小时。
(15)用搓板取出胶,置于紫外灯下观察。
本文总结了DNA的限制性酶切和DNA的琼脂糖电泳的实验原理、实验所需试剂的配制、以及酶切体系的建立及操作、DNA琼脂糖凝胶电泳的操作方法。