琼脂糖电泳protocol

 

试剂:  试样20μl    DNA ladder    琼脂糖   TAE缓冲液   上样缓冲液

含0.5μg/ml EB的电泳缓冲液

50×TAE贮存液:   Tris                    242g

冰乙酸                  57.1ml

0.5mol/LEDTA(pH 8.0)    100ml

双蒸水                 至1L

1×TAE 工作液:  40mmol/L    Tris-乙酸盐

1mmol/L     EDTA

0.8%琼脂糖凝胶:    琼脂糖     0.8g

TAE     100ml

器械  250ml锥形瓶+纸盖子+棉线绳  50ml量筒  白枪头 30μl枪  5μl枪

微波炉 电泳仪(梳子,制胶板)  凝胶成像仪

准备

1.  250ml锥形瓶,超生清洗,烘干.

2.  打开电子天平,预热.

3.  清洗制胶板,梳子,电泳槽.

步骤

1.  按配方配制TAE.

2.  250ml锥形瓶中,按配方加入琼脂糖和TAE,摇匀.  (60ml+0.48g)

用棉线绳扎紧纸盖子,盖子上要扎眼透气.缓冲液体积要小于容器体积的50%.

3.  微波炉,中火加热,不停观察,最短时间内,至琼脂糖完全融化.

4.  待胶稍冷,约60℃,倒入制胶板中.厚度3-5mm.

5.  插入梳子.梳子应在地面上0.5-1mm.

6.  rt,30-45min.凝胶完全凝结.

7.  倒入少量电泳缓冲液在凝胶顶部,小心拔出梳子.到处缓冲液.将凝胶放入电泳槽中.

8.  向电泳槽中加入缓冲液,刚好没过凝胶1mm.

9.  取约5μl上样缓冲液,与20μl试样/DNA ladder,分别混合均匀.

10.  将上述混合液,加至加样孔中. DNA ladder应在最左/右侧.

11.  关上电泳槽盖,接好电源.使DNA从负极(黑)向阳极(红)移动.

12.  给予60-70V电压.  (1-5V/cm)

13.  待缓冲液前延至胶的2/3时,关闭电源,拔出电极插头,打开电泳槽盖.

14.  小心取出凝胶,放入0.5μg/ml的EB液中,浸染30min.

15.  于凝胶成像仪,312nm,观察,摄像.

注意:

1. 配胶和灌满电泳槽要使用同一批缓冲液.因为离子强度或pH很小的差别也会在凝胶前部产生紊乱,严重影响DNA泳动.