聚丙烯酰凝胶电泳(PAGE)技术催化剂的介绍

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本文讲述了聚丙烯酰凝胶电泳(PAGE)技术的一些催化剂的具体介绍以及聚丙烯酰凝胶电泳(PAGE)技术的注意事项。

聚丙烯酰凝胶电泳(PAGE)是根据被分离物质所带来的电的荷多少及其分 子大小、形状的不同，在电场的作用下，产生不同的移动速度而分离的方法。 它具有电泳和分子筛的双重作用。

1、聚丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺单体和交联剂N1N′-亚甲基双丙烯酰 胺在催化剂的作用下聚合成含有酰胺基侧键的脂肪族长链。相邻的两个链通 过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。

常用的催化剂(包括催化剂和加速剂)有以下两种：

(1)过硫酸铵-TEMED(四甲基乙二胺)系统在Acr 和Bis 的溶液 中放入这个催化系统后，过硫酸铵产生出游离氧原子使单体成为具有游离基 的状态，从而发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。 这种催化系统需要在碱性条件下进行。例如，在pH8.8 条件下7%的丙烯酰 胺溶液30 分钟就能聚合完毕;在pH4.3 时聚合很慢，要90 分钟才能完成。 温度与聚合的快慢成正比。通常在室温下就很快聚合，温度升高聚合更快。 如将混合后的凝胶溶液放在0℃的地方，就能延缓聚合。一般来讲，温度过 低，有氧分子或不纯物质存在时都能延缓凝胶的聚合。为了防止溶液中气泡 含有氧分子而妨碍聚合，在聚合前须将溶液分别抽气，然后再混后。

(2)核黄素-TEMED 系统这是一个光激发的催化反应。核黄素在光 照下分解，黄素被还原成无色型，但在有氧条件下，无色型又被氧化成有游 离基的黄素环，使聚合作用开始。核黄素催化系统的优点是：①用量少(1mg /100mL)，对所分析的样品没有任何影响;②聚合作用所用的时间可以自由 控制，变化光照时间、强度，可使聚合延缓或加速。而过硫酸铵-TEMED 系 统的聚合作用所需的时间除了取决于温度、pH 及有氧分子或不纯物质的存 在外，还取决于它们的浓度。为了使分析的结果重复性高，核黄素催化系统 的光照时间和强度最好标准化。

凝胶的机械强度和弹性是很重要的。凝胶的软硬、透明度、粘着度都会 直接影响分离的效果。凝胶的机械性能、弹性、透明度和粘着度都取决于凝 胶总浓度和Acr 与Bis 两者之比。

其中a：b(W/W)是很关键的。当a：b〈10 时，凝胶变脆、变硬、呈乳 白色时，a：b〉100 时，5%的凝胶呈糊状，也易断裂。欲制备完全透明而又 有弹性的凝胶，应控制a：b=30 左右。不同浓度的单体对凝胶性质也有影响， 发现Acr 低于2%，Bis 在0.5%以下就不能聚合了。当增加Acr 浓度时要适 当降低Bis 的浓度。通常T 为2%~5%时，a:b=20 左右;T 为15%~20%时， a:b=125~200。

用于研究大分子核酸的凝胶多为T=2.4%的大孔径凝胶，因为太软不易操 作，最好加入0.5%琼脂糖。有的在3%凝胶中加入20%蔗糖也可增加其机械 强度而不影响其孔径大小。至于粘着度，一般来说只要容器内壁干净，单体 浓度适中，凝胶与器壁粘着附着力较大，随存放时间的延长附着力降低,有 时在电泳结束时一部分胶柱就可能从管壁上滑脱出来。

2、聚丙烯酰胺凝胶的孔径聚丙烧酰胺凝胶在电泳中不仅有防止对流， 减低扩散的能力，而且还具有分子筛的作用，这是因为聚丙烯酰胺凝胶是一 个三维空间网状结构。某一个分子通过这种网孔的能力显然取决于凝胶孔径 的大小和形状，也取决于被分离物质的大小和形状。因此，当所分离的物质 不时，凝胶越浓，孔径越小，所受阻力也就越大。