质粒DNA的鉴定——紫外吸收检测DNA的浓度和纯度

相关专题

 

目的： 了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理，掌握测定方法。

原理： 核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，单链寡核苷酸 的含量为30μg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。若比值高于1.8说明DNA样品中的RNA尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。 紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。

试剂与仪器： 提取的质粒 DNA
紫外分光光度仪

操作步骤：
1) 分光光度计 先用水在260nm和280nm两个波长下校零。
2) 取质粒 DNA样品2μl，用水稀释100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。
3) 在260nm和280nm分别读出样品光密度值。如果样品浓度单位为μg/μl，则样品DNA浓度为OD 值的10倍，即如OD260=0.1，则样品浓度即为1μg/μl。
4) 若OD260/OD280大于1.8，说明仍有RNA，可以考虑用RNA酶处理样品，若小于1.8，说明样品中含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。