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叶盘法转基因烟草技术

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一.实验目的:
学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。
二. 实验原理:
土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌,能够感染植物 的受伤部位。农杆菌中有一种环形的Ti质粒,Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区,T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列,而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。
土壤农杆菌转化植物 的常用方法是叶盘法。这种转基因方法十分简单,一般是将植物的叶片切成小圆片,用农杆菌感染后共培养2-4天,而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽,在MS培养基上生根后,再生出完整的植株。
三. 试剂及设备
1.试剂:
MS培养基:配方见“植物 的组织培养技术”实验指导
Kan:卡那霉素
Cb:羧苄青霉素
NAA:萘乙酸
6-BA:细胞分裂
T1培养基:MS培养基
T2培养基:MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+Kan100 mg/L+Cb500 mg/L
T3培养基:MS培养基+ Kan100 mg/L+Cb500 mg/L
(T2:生长培养基;T3:生根培养基)
2.仪器:
光照培养箱,恒温摇床,超净工作台,接种器械等
四.实验步骤:
1 农杆菌培养
1) 从平板上挑取含有目的基因的单菌落,接种到 3 ml YEB 液体培养基中(Str 25 μg/ml、Rif 50 μg/ml、Kan 80 μg/ml)于恒温摇床上 27℃,180 rpm 摇培过夜至 OD 600 为 0.6-0.8。
2) 摇培过夜的菌液按1%-2%的比例,转入新配置的无抗生素的 YEB 培养基中,在与上述相同的条件下培养6 h左右,OD600 为 0.2-0.5 时即可用于转化。
或: 将按上述方法培养的 OD 600 为 0.6-0.8 的菌液,转入无菌离心管中,于室温条件下,5000 rpm 离心10 min,去掉上清液,菌体用1/2 MS液体(pH 5.4-5.8)培养基重悬,稀释至OD600 为 0.2 左右,用于转化。
2 侵染
于超净工作台上,将菌液倒入无菌的小培养皿中。取不具 Kan 抗性的烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片,去主脉,将叶片剪成 0.5 cm2 的小块,放入菌液中,浸泡适当时间(一般 5-10 min)。取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
<注>:同时设未经农杆菌侵染的叶盘作为阴性对照,以下步骤同。
3 共培养
将侵染后的烟草叶片接种在不含任何激素和抗生素的MS基本培养基(T1)上,用封口膜封好培养皿,28℃ 黑暗中培养 2-4 天。
4 选择培养
将黑暗中共培养2-4天的烟草叶片转移到筛选培养基(T2)中,用封口膜封好培养皿,在光照为 2,000-10,000 lux、25-28℃、16/8 hd-1 光暗条件下选择培养。
<注>:叶盘边缘轻压入培养基中,以增加选择压力。
5 生根培养
约2-3周后,待不定芽长到 1 cm 左右时,切下不定芽并转移到生根培养基(T3)上进行生根培养,5-10天后长出不定根。
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