植物转基因技术

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一．实验目的

通过本实验的学习，了解和掌握植物 转基因技术的原理和方法，以及转基因植物的筛选和鉴定的基本过程。

二．实验原理

植物转基因技术(plant trasgenetic technology)是指把从动物、植物或微生物 中分离到的目
的基因，通过各种方法转移到植物基因组 中，使之稳定遗传并赋予植物新的性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。

1．植物 基因转化的方法

目前已发展了许多用于植物基因转化的方法，这些方法可分为3大类：一类是载体 介导的转化方法，即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA 等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中。农杆菌介导和病毒介导法就属于这种方法。

第二类为基因直接导入法，是指通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中。物理方法包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等；化学方法有PEG 介导转化方法和脂质体法等。第三类为种质系统法，这包括花粉管通道法、生殖细胞浸染法、胚囊和子房注射法等。

(一) 载体介导的转化方法

1 根癌农杆菌介导转化法

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌。它能在自然条件下感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤(crown gall tumor)。根癌农杆菌细胞中含有Ti 质粒(tumor-inducing plasmid，瘤诱导质粒)。

在Ti 质粒上有一段T-DNA(T-DNA region)，即转移-DNA(transfer-DNA)，又称为T区(T region)。根癌农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA 插入到植物基因组中。因此，根癌农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。

人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA 区，借助根癌农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

（1） Ti 质粒的结构与功能

Ti 质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合的环状DNA分子。Ti 质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类，Ti 质粒可分为4 类：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)和农杆菌素碱型(agrocinopine)。

Ti 质粒可分为4 个功能区域：

①T-DNA区(transferred-DNA region)：T-DNA是根癌农杆菌侵染植物细胞时从Ti 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA；

②Vir 区(virulence region)：Vir 区上的基因能激活T-DNA 转移，使根癌农杆菌表现出毒性；

③Con 区(regions encoding conjugations，接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移；

④Ori区(origin of replication，复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我复制。

T-DNA上共含有tms、tmr 和tmt 3 套基因。其中tms 和tmr 2 套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。tms基因组由iaaH和iaaM 2 个基因组成，控制由色氨酸产生生长素吲哚乙酸的生物合成途径；

tmr 基因组中的iptZ 负责由异戊烯焦磷酸和AMP 合成分裂素的反应；tmt 基因组的编码产物可催化合成冠瘿碱(Opines)。冠瘿碱的代谢产物为氨基酸和糖类，是根癌农杆菌生长必需的物质，供根癌农杆菌作为营养使用。

此外，在T-DNA 的两端还含有左右2 个边界，左边界(left border, LB)和左边界(right border, RB)是长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。

（2）Ti 质粒的转化机理

根癌农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位会分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质能诱导Ti 质粒上的vir基因以及根癌农杆菌染色体上的一个操纵子表达。vir 基因产物将Ti 质粒上的T-DNA 单链切下，而根癌农杆菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA 结合形成复合物，转化植物根部细胞。

整个过程大致可分为以下几个步骤：

①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着；

②根癌农杆菌对植物信号物质的感受；

③根癌农杆菌Ti 质粒上的vir 基因以及染色体上操纵子的活化；

④T-DNA 复合体的产生；

⑤T-DNA复合体的转运；

⑥T-DNA整合到植物基因组中。

（3）野生型Ti 质粒的改造和中间载体的构建

Ti 质粒是植物基因工程的一种天然载体。但野生型Ti 质粒不能直接用作克隆外源基因的载体。这主要表现在：

①野生型Ti 质粒分子过大，因而在基因工程中操作起来十分麻烦；

②野生型Ti 质粒上分布着各种限制型核酸内切酶的多个酶切位点，不论用何种限制型核酸内切酶切割，都会切成很大片段。而且即使在T-DNA 上也很难找到可利用的单一的酶切位点；

③T-DNA上的tms 和tmr 基因产物将干扰受体植物内源激素的平衡，导致冠瘿瘤的产生，阻碍转基因植物细胞的分化和植株的再生；

④冠瘿碱的合成过程消耗大量的精氨酸和谷氨酸，直接影响转基因植物细胞的生长代谢；

⑤野生型Ti 质粒没有大肠杆菌(Escherichia coli) 的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。因此，必须对野生型的Ti 质粒进行改造后才能作为转基因植物的载体。

对野生型Ti 质粒的改造，主要包括以下几个方面：

①删除T-DNA上的tms、tmr和tmt基因；

②加入大肠杆菌复制起点和选择标记基因，构建根癌农杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒，便于重组分子的克隆与扩增；

③引入植物细胞的筛选标记基因，如细菌来源的新霉素磷酸转移酶II基因(neomycin phosphotransferase II, NPT II)等，便于转基因植物细胞的筛选；

④引入植物基因的启动子和polyA化信号序列；

⑤插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆。

⑥除去Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度。由于大肠杆菌具有能与根癌农杆菌高效接合转移的特征。

因此，为了使Ti 质粒成为有效的外源基因导入载体，科学家们将T-DNA片段克隆进大肠杆菌的质粒，并插入目的基因，而后通过接合转移将目的基因引入到根癌农杆菌的Ti 质粒。

带有重组T-DNA的大肠杆菌衍生载体称为中间载体(intermediate vector)，而接受中间载体的Ti 质粒则称为受体Ti 质粒(acceptor Ti plasmid)。构建中间载体是解决Ti 质粒不能直接导入目的基因的有效方法之一。