DNA分型技术

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自1985年英国遗传学家Alec Jeffreys建立DNA指纹技术以来，经过近20年的发展，法医DNA分析先后已建立了DNA指纹技术，PCR扩增片段长度多态性分析技术、线粒体DNA测序 和DNA蕊片等主要技术，结合其它一些新的技术方法，如MVR-PCR，PCR-SSO，SSP-PCR、DHLPC、TOMEF等，共同形成了现代法医DNA技术。随着新的DNA遗传标记的不断被发现，各种新的DNA分析、分型技术方法的建立，法医DNA分析技术正朝着快速，准确，灵敏度和自动化程度高的方向飞速发展。
1. 聚合酶链式反应
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR )，是近年发展起来的一种体外扩增特 异DNA片段的技术。在1985年由Kary Mullis创立。此法操作简便，短时间内在试管中可获得数百万个特异DNA序列的拷贝。1993年Mullis因此获得了诺贝尔奖。PCR技术已迅速渗透到分子生物学的各个领域，在分子克隆、遗传病的基因诊断、法医学、考古学等方面得到了广泛的应用，而且与PCR相关的技术不断被开发应用。目前大多数法医DNA分析技术均以PCR技术为基础进行分型。
PCR 技术的原理
PCR 技术实际上是模拟生物体内的在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的体外DNA酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性，引物是PCR反应中最主要的成分。反应分三步：(1)变性(denaturation)：首先是双链DNA分子在95℃左右高温下加热，DNA双螺旋配对碱基间的氢键断裂，双链 解离成单链DNA；(2)退火(annealing)：降低温度使引物和其互补的模板形成杂交链。由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，模 板DNA双链之间互补的机会较少； (3)延伸(extension)：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖 核苷酸底物及Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的5′→3′方向的DNA链延伸反应。
经过高温变性，低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的序 列不断得到扩增。每循环一次，目的DNA的拷贝数加倍，随着循环次数的增加，目的 DNA以指数的形式堆积，数量可达2 ×105～7拷贝。在反应的最初阶段，原来的DNA担负 着起始模板的作用，随着循环次数的递增，由引物引导延伸的片段急剧地增多而成为主要模板。因此，绝大多数扩增产物将受到所加引物5′末端的限制，最终扩增产物是介于两种引物5′端之间的DNA片段。
在一个PCR 体系中同时扩增多个基因座的方法叫做复合扩增（Multiplexing PCR）。复合扩增的PCR反应体系仍由反应缓冲液、dNTP、引物、模板、DNA聚合酶及Mg2+组成，扩增的反应体系组成和扩增热循环条件相同，唯有引物是多对。复合扩增提高单次检测的信息量，克服了单位扩增时必须分别加入引物，分别扩增，分别电泳的缺点。同时，复合扩增可以减少检材用量。目前，银染系统和荧光标记自动检测系统检测多个基座时，通常都采用复合扩增的方法。
PCR技术具有敏度高、特异性强、种属特异性好、适于降解DNA检材、扩增产物分析方法多样化等特点，一些新的PCR相关技术在法医DNA分析得到应用.
2. PCR—RFLP技术
PCR—RFLP是在RFLP分析方法的基础上发展建立的一种更为简便的DNA分型技术。PCR—RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。已广泛应用于AB0、HLA、线粒体DNA等序列多态性分析中。
PCR—RFLP与DNA—RFLP分型方法相比，虽有很大的改进，但酶切条件要求较高， 受影响因素较多，有时PCR扩增产物不能完全被内切酶消化切割；有时区分所有的等位基因比较困难。
3.PCR—SSO技术
序列特异性寡核苷酸—聚合酶链反应(Sequence Specific Oligonucleotide-PCR，PCR- SSO)或等位基因特异寡核苷酸—聚合酶链反应(Allelic Specific Oligonucleotide- PCR，PCR-ASO)是利用合成与一种或多种等位基因特异碱基序列的互补寡核苷酸探针，并与特定片段的PCR扩增产物在一定离子强度的杂交液和温度下进行杂交，杂交完毕后进行检测判别有无结合。检测有碱基序列差异的特定等位基因多态性。其检测可采用放射性同位素或荧光免疫检测系统。目前在国外多采用荧光标记法。PCR—SSO是目前应用最多的一种简单、快速而又精确的HLA—Ι、Ⅱ类DNA分型方法，能鉴定所有已知序列的HLA—A、B、DR、DQ、DP等位基因，精确地分析DNA的多态性。
SSO方法的优点是快速方便，可以在短时间内检测大量样本。缺点是探针检测的位点有限，某些未知的位点不能很好的被检测出来。
杂交反应是在固定有探针或扩增产物的杂交膜上进行， 如把扩增产物先固定在膜上，用标记好的已知序列的寡核苷酸探针去杂交检测的称“正向杂交”。反之，先将已知序列的寡核苷酸按顺序固定在膜上，在PCR扩增过程中标记扩增产物或在扩增后标记扩增产物，用这种带标记的扩增产物与固定在膜上的寡核苷酸序列杂交来检测扩增产物的序列，根据寡核苷酸在膜上固定的顺序来确定待测等位基因的序列的方法，称“反向杂交”。正向、反向杂交技术各有特点，正向杂交更适合于大批量筛选，反向杂交对较小数量分析更能体现它的优点，目前反向杂交应用较广。
PCR-ASO技术即把固相载体上固定的探针通过杂交检测靶基因扩增片断。PCR-ASO技术主要分四步进行：PCR扩增、杂交、显示杂交信号、杂交结果的分析。在PCR缓冲液中加入大量DNTPs，生物素标记结合引物和耐热稳定性DNA多聚酶，然后加入DNA样品进行PCR扩增，引物用于扩增DNA序列的特异位点。加热后，DNA螺旋的两条带分开（变性），引物的目的结合位点暴露。然后再降至某一特定温度后，引物将与其互补的序列相结合（退火），然后，在另一个特定温度下，热稳定性DNA聚合酶在大量DNTPs存在下沿着模板链扩增延长退火后，引物（延伸）以此方法一个循环后，两个生物素标记了的目的序列产生。经过多次循环，大量的生物素标记的目的基因序列产生扩增后的生物素酰化DNA样品经化学变性，每条链与固定基试剂条上的等位基因线列特异性的寡核苷酸探针杂交。然后快速冲洗以去除所有错配的扩增DNA。冲洗后加入碱性磷酸酶结合的链亲合素，使之与生物素酰化的杂交产物结合，然后再与包含染色剂的底物溶液一起孵育产生紫色/棕色沉淀。冲洗以终止反应，用探针的反应格局表记录结果。