常用HLA DNA分型技术的特点
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常用HLA DNA分型技术的特点
1 、PCR-SSO
PCR扩增的序列是具有多态性的HLA等位基因外显子，HLA-I类基因主要是第2和第3外显子，HLA-II类基因主要是第2外显子，PCR扩增产物用一组探针进行杂交，每一探针与相应型别的HLA等位基因序列互补。HLA等位基因特异性的探针可以检测已知序列的HLA等位基因。因此PCR-SSO是一种常用而精确的HLA基因分型方法，通常是将多个待测样本的PCR扩增产物固定在同一杂交膜上，然后分别与不同的探针杂交，所以该方法特别适用于大批量样本的分型；缺点是设备要求高、操作过程复杂，难以在短时间内完成全部HLA等位基因的分型。
为了简化上述方法的操作步骤和缩短分型时间，根据SSO分型原理，建立了反向SSO分型方法。该方法是将一组HLA-I类或II类等位基因特异性探针固定在同一杂交膜上，PCR扩增产物经过生物素或其他标记物标记后，与固定在杂交膜上的探针杂交。洗涤后加入链亲和素-过氧化物酶偶联物和相应底物，显示与探针杂交的PCR扩增产物。反向SSO分型方法操作简单，耗时短（4～6小时），并且适合小量样本的分型。主要缺点是使用商品化的分型试剂盒和费用高。
2 、PCR-RFLP
通过PCR扩增HLA基因的多态性区域，用限制性核酸内切酶酶切分析HLA等位基因的型别。由于所有HLA等位基因的序列基本上已阐明，PCR扩增的多态性区域内的限制性核酸内切酶识别位点是确定的。因此，用各种内切酶对待侧样本PCR扩增产物进行酶切，其酶切片段的数目和长度取决于样本HLA等位基因的序列。虽然PCR-RFLP分型方法的分型精确度远高于血清学方法，但是操作步骤繁多，结果判断复杂，特别是在某些杂合子情况下；另外，该方法需要用多种限制性核酸内切酶进行酶切分析，时间和费用的消耗较大。
3 、PCR-SSP
该方法是利用与HLA等位基因序列互补的引物，对待测样本DNA进行特异性PCR扩增。由于每对特异性引物所鉴定的是顺式排列的HLA等位基因序列，所以该方法的分辨率高，而且容易鉴定出杂合子。PCR-SSP分型方法使用的特异性引物与模版DNA完全互补，而且使用的Taq多聚酶没有核酸外切酶的活性，因此不象通常PCR扩增时允许3’末端可以有一个或几个碱基错配，即使特异性引物发生非特异性退火，也不致于发生非特异性扩增。特异性PCR扩增产物很容易用琼脂糖凝胶电泳检测，根据特异性PCR扩增产物的出现与否，对待侧样本的HLA等位基因型别进行判断。PCR-SSP分型方法 操作简单、耗时短（3～5小时），对设备要求不高，结果判断容易；缺点是合成多对HLA等位基因特异性的引物一次性投资较大。
4 、PCR-SBT
PCR-SSO和PCR-SSP分型方法均不能检出已知HLA等位基因序列之外的遗传信息，从而造成新等位基因的漏检或分型错误。对于罕见的HLA等位基因型别，这二种方法都无能为力，而DNA测序法能够解决这一问题。待测样本HLA基因经过PCR扩增后，通过DNA测序来鉴定HLA等位基因型别，这种方法称为PCR-SBT（基于测序的分型，sequencing-based typing）。
PCR-SBT的原理是用两侧引物对HLA基因多态性的区域进行PCR扩增，然后对扩增产物进行DNA测序，在计算机辅助下确定HLA等位基因型别。由于杂合子样本的PCR扩增产物中含有两条不同的DNA序列，所以必须利用计算机来参照全部已知等位基因序列，从而对待测样本进行HLA分型。该方法的主要缺点是设备要求高，时间和费用的消耗大。
值得注意的是，上述的分型方法都不可能百分之百的正确，某些等位基因序列中GC倒位可以导致分型错误，即使是PCR-SBT分型方法也常常不能分辨出杂合位点是顺式还是反式杂合状态。
